グラミン生合成の鍵となる新規転位反応とcyt. P450の解析

Research Project

Project/Area Number	22K05455
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 38040:Bioorganic chemistry-related
Research Institution	Tokyo University of Agriculture
Principal Investigator	須恵雅之東京農業大学, 応用生物科学部, 教授 (10328544)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000) Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000) Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Keywords	植物二次代謝 / 生合成経路 / シトクロームP450 / トリプトファン / 二次代謝 / オオムギ / グラミン
Outline of Research at the Start	オオムギは、トリプトファン(Trp)由来の二次代謝産物であるグラミンを耐病性二次代謝産物として生産する。Trpからグラミンに至る生合成過程で、炭素原子2個分の減炭反応が起こるが、その経路の詳細は不明である。この過程には炭素-窒素 (C-N) 間の新規転位反応が含まれると予想され、新たに単離したcyt. P450 (CYP)がその減炭反応に関与していると考えられる。このCYPによる新規反応のメカニズムと植物二次代謝における役割を明らかにすることで、植物二次代謝化合物の基本骨格形成に関わる新規反応系を提示するとともに、多くの生物が持つ重要酵素CYPの新たな機能を明らかにするものと期待できる。
Outline of Annual Research Achievements	オオムギは、グラミンをトリプトファン(Trp)から生合成する。その生合成過程で、Trp側鎖の炭素原子が2個分減少してアミノメチルインドール(AMI)が生成するが、その経路の詳細はこれまで明らかになっていない。最近の我々の研究で、この反応には炭素-窒素 (C-N) 間の新規転位反応を行う新規cyt. P450 (CYP)の関与が示唆されたことから、本課題では、グラミン生合成経路の解明とオオムギ由来新規CYPの反応機構解析を目指した。本年度はまず、イネにCYPとNMT (AMIからグラミンを合成する酵素)を導入し、代謝産物を解析した結果、形質転換体においてAMIとグラミンの生産がLC-MS上で確認でき、このCYPがグラミン生合成に関わっていることが強く示された。CYPの機能をより直接的に評価するため、CYP遺伝子を酵母Pichia pastorisに導入し、ミクロソーム画分を調製することでその活性をin vitroで検出することを試みた。その際には、CYPに電子を供給するために、シロイヌナズナ由来CYP還元酵素であるATR1を同時に発現させた。ミクロソーム画分をTrpに対して反応させたところ、AMIの生成が確認できたことから、この新規CYPはTrpを直接AMIに変換する活性を持つことが示された。Trp側鎖の炭素2個を1段階で除去する酵素はこれまで知られておらず、このCYPが新規の反応を触媒していることが示唆された。また、オオムギ新規CYPの反応を詳細に解析するため、主にTrpの構造類縁体を用いて、それらに対する反応性や、Trp-AMI変換活性に対する影響をミクロソーム画分を用いて検討した。結果として、Trpのメチルエステル体などが阻害剤となる可能性が示され、今後、阻害様式の精査や構造展開を行うことで反応機構解析に供試しうる阻害剤の開発につながる可能性がある。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason RNA-seqにより単離した新規CYP遺伝子の機能を評価するため、当初の計画通り、イネ胚盤カルスにアグロバクテリウム法により遺伝子を導入し、再分化体を得ることができ、代謝産物の定量を行った。本遺伝子のグラミン生合成への関与をin vivoで確認することができたことから、予定通りの進捗といえる。現在、ホモ系統を複数ライン確立するため、栽培を継続中である。上記のin vivoでの機能評価に加え、酵素活性をin vitroで評価することを初年度は計画しており、酵母を用いた異種発現系の構築およびアッセイを目指した。酵母としては当研究室で実績のあるPichia pastorisを使用することとし、CYPへの電子供給のためにシロイヌナズナ由来NADPH-CYP還元酵素(CPR)であるATR1遺伝子（コドン頻度を最適化した人工遺伝子）を併せて導入することにした。ウエスタンブロッティングにてタンパク質の発現を確認したのち、ミクロソーム画分を用いた評価を行うことで、このCYPがTrpに対して新規の側鎖短縮反応を触媒することを確認することができた。また、複数の芳香族アミノ酸類縁体を用いた評価も行い、CYPの基質特異性や阻害剤に関する知見を得ることができた。このように、in vitro評価系での進捗も、当初の計画に沿ったものといえる。
Strategy for Future Research Activity	初年度で、オオムギ新規CYPがこれまでに例のないTrp側鎖の短縮を行うことが示されたことから、続いてこの反応のメカニズムを解明することに取り組む。Trp側鎖アミノ基がそのままAMIに取り込まれることが示唆されているので、まず始めに、同位体標識をしたTrpに対してCYPを発現しているミクロソーム画分を反応させ、生成物をLC-MSで解析することにより同位体の取り込みを検出する。現在予定している標識体は、Trp中の窒素原子を2箇所15Nに置換したもので窒素原子の挙動を解析し、また、それに加えてbeta位水素を重水素置換することで、反応過程でどのような中間体を経ているかについて情報を得る。また、脱離する炭素原子2つがどのような化合物として脱離しているかを解析することで、CYPの反応機構に関する知見を得てゆく予定である。初年度において、阻害剤となり得る化合物を見いだしたことから、阻害剤の作用様式を詳細に解析することで、基質認識や反応に要求される構造的要因について解析していきたいと考えている。本課題での反応は新規性の高いものを推察されることから、酵素機能の解析をより詳細に行うため、P. pastorisでの異種発現に加えて、大腸菌を用いた発現系の構築を目指し、将来的な結晶構造解析に結びつく基盤構築に取り組みたいと考えている。 CYPの機能解析に加えて、グラミン生産能獲得による病害抵抗性の評価を計画しているが、現在、T1世代の育成中である。抵抗性評価のためには、少なくとももう一世代栽培する必要があることから、今年度後半に、取り組み始める予定である。また、現在のCaMV35Sプロモーターを用いての過剰発現では、若干の生育不良がみられることから、組織特異的に発現をするプロモーターに置換しての組換え体作成も試みる予定である。