| Project/Area Number |
22K05547
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 38050:Food sciences-related
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| Research Institution | Nippon Veterinary and Life Science University |
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Principal Investigator |
落合 由嗣 日本獣医生命科学大学, 獣医学部, 教授 (40350178)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
武藤 淳二 科学警察研究所, 法科学第一部, 主任研究官 (80432186)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2024: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2023: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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| Keywords | リステリア / sublethal stress / コロニー多様性 / 損傷菌 / 低pH曝露 / 高温曝露 / ピルビン酸 / 覚醒 / 休眠 / 菌分離 |
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| Outline of Research at the Start |
食中毒原因菌のリステリアによる食品汚染が発生する原因の一つとして、食品加工施設で生存するものの既存の方法では分離されない菌の存在が見逃されていると考えられる。近年、多くの細菌種が生育に困難な状況下で培養困難な状態（休眠状態）になることで危機的状況を克服していることがわかってきた。本研究ではリステリアが食品加工施設で置かれることが想定されるストレス曝露などへの対応として難培養性を伴う休眠状態となるかを明らかにする。さらに、休眠状態のリステリアを覚醒させる培養条件を探索し、その覚醒誘導を利用した新規分離方法の開発によって食品加工施設で見逃されているリステリアを確実に検出できる技術の確立を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまでの成果として、亜致死的（sublethal）条件へ曝露したリステリアを寒天培地上に接種したところ、曝露時間に依存して形成されるコロニーが小さくなる知見を見出した。さらに過酸化水素や高温に継続曝露した後に寒天培地上での発育性状を解析したところ、ピルビン酸を添加した寒天培地のみでコロニー形成が観察される知見を得てきた。以上から、発育・生残に不都合な環境に置かれたリステリアでは、その環境への曝露時間に依存して増殖性低下が起きていることが示された。今年度においては、sublethalな条件に置かれた後に寒天培地上に形成されるコロニーの大きさを詳細に解析した。
リステリアは食肉分離株を用いた。常法によって培養・洗浄した菌をsublethal条件に曝露した。曝露条件は、過酸化水素（0.2%）、高温（50℃、55℃）、低pH（HClで3.0に調整したもの）とした。曝露後に菌浮遊液を回収、適宜希釈して2種類の培地、すなわち酵母エキス添加トリプトソイ寒天培地（TSAYE）、およびピルビン酸添加TSAYE（TSAYE-PYR）に接種した。37℃で培養し、24および48時間後において形成されるコロニーの大きさを計測した。
sublethal条件に曝露後のリステリアが形成するコロニーは、曝露条件に関係なく小さくなることが確認された。今回の解析で着目したのはコロニーの大きさの多様性である。曝露初期においては小型化したコロニーの大きさに顕著な多様性は観察されなかったものの、長期間にわたる曝露によって大きさに著しい多様性が認められた。コロニーの大きさは増殖性の多様性、すなわち表現型の多様性を示唆しており、本菌が不都合な環境での生残する戦略として発揮されていることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
曝露解析において得られるコロニー数が著しく異なる成績が得られた。そのため、実験系において何らかの不備があることが懸念され、詳細な条件検討を繰り返すことに時間を要した。以上の理由から当初の計画よりも進行が遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後も亜致死的な条件に置かれたリステリアがより効果的にコロニーを形成できる培養条件（培養温度、栄養条件、好気・微好気・嫌気条件）継続して模索することを計画している。
また、同じ遺伝子型に分類される一方で、低pHに対する感受性が著しく異なる分離株を見出した。異なる感受性がどのようなメカニズムに起因するかを解明するため、次世代シーケンスによって全ゲノムの塩基配列を決定し、低pHなどのストレスへの応答に関わる因子の塩基配列を中心に変異があるかを検索する。変異が見出された部分の塩基配列に置換を入れることによって耐性に影響がみられるかを解析する。
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