Development of RNA editing by RNA polymerase of influenza virus

Research Project

Project/Area Number	22K05555
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 38060:Applied molecular and cellular biology-related
Research Institution	Shinshu University
Principal Investigator	小笠原慎治信州大学, 学術研究院理学系, 助教 (50462669)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000) Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Keywords	RNA編集 / インフルエンザウイルス / RNAポリメラーゼ / キャップスナッチング
Outline of Research at the Start	DNAを傷つけずに遺伝情報を編集できるRNA編集が遺伝性疾患の治療に有用だと注目を集め始めた。しかし、既存のRNA編集技術は一つの塩基を別の塩基に変換する点編集しかできない。本研究では、インフルエンザウイルスのRNA依存性RNAポリメラーゼを用いて指定した場所以降の配列を自由に書き換える新しいRNA編集技術「RNAオーバーライティング」を開発する。 RNAオーバーライティングは配列の追加・削除、変異の導入・修正などあらゆる編集が可能であり、遺伝子の大幅な欠損や変異が原因で起こる遺伝性疾患を含め、多くの遺伝性疾患の治療に応用できると期待される。
Outline of Annual Research Achievements	インフルエンザウイルスのRNA依存性RNAポリメラーゼ（RdRp）を利用してmRNAの配列を自由に編集する新しいRNA編集技術「RNAオーバーライティング」を開発することが本研究の目的である。本年度は当初の計画通り①効率的なRNAオーバーライテングに必要な補助タンパク質の調査、②標的mRNAにRdRpを誘引する方法の選定をおこなった。 ①効率的なRNAオーバーライテングに必要な補助タンパク質の調査：　細胞内でのRNAオーバーライティングの効率を見積もるため、緑色蛍光タンパク質のmRNAを赤色蛍光タンパク質のmRNAに書き換える蛍光レポーターアッセイを構築した。補助タンパク質にはヌクレオプロテイン（NP）、核外輸送タンパク質（NEP）およびマトリクスタンパク質（M1）があり、これらの内NPは必須であり、NEPおよびM1は必須でもなければRNAオーバーライティング効率の向上にも寄与しないことが分かった。 ②標的mRNAにRdRpを誘引する方法の選定：　RdRpを標的mRNAに誘引するためのRNA-タンパク質相互作用系の選定をおこなった。それに先立ち、RdRpに融合するタンパク質の大きさがRdRpの活性に及ぼす影響を調べた。その結果、融合するタンパク質が大きくなるに従ってRdRpの活性が低下することが分かった。また、RdRpを構成する３つのサブユニット（PA, PB1, PB2）のどれのどの位置に融合するかによって活性の低下の度合いが異なることも分かった。これらの結果に基づき、PAまたはPB2のC末端にRdRp誘引用タンパク質を融合することにした。BoxB-λN、BoxC/D-L7AeおよびcrRNA-Cas13bの３つのRNA-タンパク質相互作用系を試したところ、crRNA-Cas13bを用いた場合においてRNAオーバーライティングの効率が最も高く、21％であった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 予期せぬ大きな問題もなく当初の計画通りに進んでいる。
Strategy for Future Research Activity	当初の研究計画通りに進める。