Development of RNA editing by RNA polymerase of influenza virus

Research Project

Project/Area Number	22K05555
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 38060:Applied molecular and cellular biology-related
Research Institution	Shinshu University
Principal Investigator	小笠原慎治信州大学, 学術研究院理学系, 助教 (50462669)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000) Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Keywords	RNA編集 / インフルエンザウイルス / RNAポリメラーゼ / キャップスナッチング
Outline of Research at the Start	DNAを傷つけずに遺伝情報を編集できるRNA編集が遺伝性疾患の治療に有用だと注目を集め始めた。しかし、既存のRNA編集技術は一つの塩基を別の塩基に変換する点編集しかできない。本研究では、インフルエンザウイルスのRNA依存性RNAポリメラーゼを用いて指定した場所以降の配列を自由に書き換える新しいRNA編集技術「RNAオーバーライティング」を開発する。 RNAオーバーライティングは配列の追加・削除、変異の導入・修正などあらゆる編集が可能であり、遺伝子の大幅な欠損や変異が原因で起こる遺伝性疾患を含め、多くの遺伝性疾患の治療に応用できると期待される。
Outline of Annual Research Achievements	インフルエンザウイルスのRNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp)を利用してmRNAの配列を自由に編集する新しいRNA編集技術「RNAオーバーライティング」を開発することが本研究の目的である。本年度は当初の計画通り以下２つのテーマを行った。 1. RdRpの小型化はどこまで許容されるのか？。 RdRpを構成する３つのサブユニット（PA, PB1, PB2）の内ポリメラーゼの転写反応に直接関与しないPB2の小型化を試みた。PB2のC末端からドメインを１つずつ削除したPB2を発現する６種類のプラスミドを構築した。小型化PB2のプラスミドとその他のサブユニットのプラスミドをHEK293T細胞にコトランスフェクションし小型化リコンビナントRdRdを得た。また、細胞内でのRNAオーバーライティング効率を蛍光レポーターアッセイにより評価した。結果、小型化リコンビナントRdRdを用いたRdRpの活性評価では、N2ドメインまで削除してもRNAオーバーライティングは起った。しかし、細胞内ではどの小型化PB2を用いた場合でも、RNAオーバーライティングはほとんど起こらなかった。 2.テンプレートRNAの配列設計はどこまで自由度があるのか？。テンプレートRNAの末端領域をワイルドタイプの配列からmScarletの配列へ変更し蛍光レポーターアッセイを用いてRNAオーバーライティングの効率を評価した。その結果、配列を置き換えた場合、ワイルドタイプと比較して20％程度の効率に落ち込んだ。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 予期せぬ大きな問題もなく当初の計画通りに進んでいる。
Strategy for Future Research Activity	概ね当初の予定通り進める。2023年度に開始したテンプレートRNAの配列設計はどこまで自由度があるのか？を引き続き行い、より詳細に調べる。加えて、アクチンのmRNAを標的にした内在mRNAのRNAオーバーライティングを試みる。