トマトのゲノム編集によるノックイン技術の確立及び発現調節法の開発

• Project/Area Number: 22K05577
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 39010:Science in plant genetics and breeding-related
• Research Institution: National Agriculture and Food Research Organization
• Principal Investigator: 伊藤 康博 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 食品研究部門, 主席研究員 (90353987)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
• Keywords: トマト / ゲノム編集 / ノックイン / ジーンターゲッティング

Outline of Research at the Start

植物におけるゲノム編集技術において、標的位置に目的のDNAを挿入する「ノックイン」は開発途上にある。ここではトマトでノックイン法を確立し、広く応用可能な2種のアプリケーションとして「翻訳エンハンサー挿入による高発現技術の開発」「転写因子チューニング法の確立」の二つについて技術開発を行う。

Outline of Annual Research Achievements

トマトゲノム上のGGPS2遺伝子の翻訳開始点直前に、タバコモザイクウィルスの翻訳エンハンサー配列であるオメガ配列を、CRISPR/Cas9法を応用してノックインすることに取り組み、再分化した植物から候補となる株を見出した。現在はPCR法で確認する限り、ノックインに成功していると思われ、植物体を育成中である。ただし、ゲノムが倍加して４倍体になっている可能性がある。トマトの組換え体作出では４倍体が発生しやすく、昨年度までに得たRIN遺伝子に対するノックイン系統も４倍体であったことから、２倍体へ戻す安定的な方策が必要となるかもしれない。また、トマトゲノムから翻訳エンハンサー配列の候補配列を探索し、この候補配列を接続したルシフェラーゼ遺伝子をプロトプラストで一過的発現させたところ、ルシフェラーゼ活性が増強されたことを確認した。この活性は、オメガ配列を使用した時よりも強く、既に報告されているタバコ由来の配列と同等の活性があった。配列を削り込んで、より短い配列で同等の活性を示す部分配列も得ることに成功した。さらにアグロインフィルトレーション法を用いたベンサミアナタバコ葉におけるEGFP遺伝子の発現による蛍光強度を指標とした翻訳活性化の試験を行い、やはり本配列の翻訳エンハンサー活性が確認できた。予定外の成果として、ゲノム編集による変異の種類を容易に増やせる方法を見出したので、論文としてまとめているところである。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

トマトのゲノム編集によるノックインについて、狙った位置に目的の配列のみを導入することは予想通りに稀にしか起こらない現象であったが、形質転換条件の検討やスクリーニング法の確立により、大量の組換え体を作出してノックイン個体を選抜することが可能であることが分かってきた。数百以上の再分化植物から１個体得られるか得られないか、という低効率であるため力業的な面があるが、一度得られれば簡単には真似されない変異体となるため、本手法を継続して安定化させることを行っている。ただし予想外の問題点として、得られたノックイン植物が、組織培養中にゲノムが倍加して４倍体になっており、そのままではその後の研究には利用できなくなっている。２倍体との交配では種子ができないことも確かめており、何らかの解決策に取り組む必要があり、さらに研究の進行が遅くなる可能性もある。トマト由来のエンハンサー配列に関しては、期待通りの活性を持つ配列が得られたため、そちらの課題は順調に進んでいる。

Strategy for Future Research Activity

まずは得られているGGPS2遺伝子を標的としたノックイン実験で得られた候補植物について、間違いなくオメガ配列が挿入されているのかを確かめる。また倍数性を確認して、２倍体ならそのまま植物体の性状を調査し、タンパク質の発現が確かに向上したのかを明らかにして、手法の妥当性を示す。４倍体になっていた場合は、２倍体に戻す方法を模索する必要がある。半数体を誘導する遺伝子操作法が報告されているので、４倍体からの半減にも応用できるのか、手法の確立が必要となる。トマトの形質転換では４倍体が発生しやすいため、この倍数性を戻す手法が確立できれば応用範囲が広い。また並行して、トマトのエンハンサー配列を実際にトマトゲノムにノックインする実験についても着手する。