ORNi-PCR法によるリンゴ黒星病菌における防除剤耐性変異株の高速検出法の開発

Research Project

Project/Area Number	22K05644
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 39040:Plant protection science-related
Research Institution	Hirosaki University
Principal Investigator	清水武史弘前大学, 医学研究科, 客員研究員 (90374818)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000) Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000) Fiscal Year 2022: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Keywords	黒星病 / リンゴ / ORNi-PCR / 一塩基変異 / CYP51A1
Outline of Research at the Start	青森県の基幹産業であるリンゴ栽培に甚大な被害をもたらすリンゴ黒星病は近年多発傾向にあり、要因の一つとしてCYP51A1遺伝子の変異による防除剤（ステロール脱メチル化阻害剤）耐性菌の出現があげられる。防除に先立ち、黒星病菌のCYP51A1遺伝子が変異をもつかどうかを判別する必要があるが、従来法は判別に数ヶ月を要するためその間に黒星病が更に蔓延する危険性が高い。本研究は、研究代表者の所属講座で開発した、遺伝子変異を迅速・簡便・安価に判別できるORNi-PCR法を用いて、黒星病菌のCYP51A1遺伝子変異を約2時間で判別する技術を確立する。本研究はリンゴ黒星病の早期防除の実施に繋がり意義が大きい。
Outline of Annual Research Achievements	リンゴ黒星病は青森県の基幹産業であるリンゴ栽培に甚大な被害をもたらす。防除剤として、黒星病菌のCYP51A1蛋白質が持つ脱メチル化活性の阻害剤（DMI剤）が用いられるが、同蛋白質をコードするCYP51A1遺伝子の一塩基変異により複数のDMI剤耐性変異株が出現する。よって、防除剤散布に先立ち変異の有無や変異塩基の特定が必要だが、現行法はその判別に一～数ヶ月を要するため、より迅速な手法が求められている。研究代表者らは、Oligoribonucleotide (ORN) interference-PCR（ORNi-PCR）法が様々な遺伝子の一塩基変異を迅速・簡便に特定できることを示してきた。本研究は、黒星病の早期防除法の開発に向けて、ORNi-PCRによるCYP51A1遺伝子の一塩基変異検出法を確立し、約2時間で変異株を特定できるシステムの構築を目的とする。 CYP51A1蛋白質には、DMI剤耐性を示す4種類のアミノ酸配列の変異型（Y133F、M141I、E206Q、G427R）が存在し、これらはいずれもCYP51A1遺伝子の一塩基変異に起因する。令和4年度は、培養黒星病菌のDNAを鋳型としたORNi-PCRにより、CYP51A1遺伝子の野生型と各変異型を判別できることを示した。令和5年度は、リンゴ樹木の黒星病罹病葉の病斑からDNAを抽出して前年度と同様の検討を行った。その結果、病斑における黒星病菌が、CYP51A1遺伝子の「野生型」であるか「いずれかの変異型」であるかが判別可能となった。ただし、一つの病斑に複数の遺伝子型の黒星病菌が混在している場合も多く、例えば野生型と変異型の混在や、ある変異型と別の変異型の混在などが実際にみられる。こうした病斑に「どの変異型の黒星病菌が混在しているか」を決定するには、ORNi-PCR反応条件の更なる検討が必要で、今後の課題である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 「研究実績の概要」に記載の通り、黒星病罹病葉の病斑から抽出したDNAを鋳型として、ORNi-PCRによりCYP51A1遺伝子の「野生型」と「いずれかの変異型」を判別する反応条件を決定できた。しかし、　一つの病斑に複数の遺伝子型の黒星病菌が混在している場合も多く、例えば「野生型」と「変異型」の混在や、「ある変異型」と「別の変異型」の混在などが実際にみられる。こうした病斑に「どの変異型の黒星病菌が混在しているか」を特定するには、ORNi-PCR反応条件の詳細な検討が必要である。令和5年度は、この課題を解決するためORNやプライマーの設定部位、長さ、ORNi-PCRの反応温度など細かい調整を試みたが、個々の変異型を明確に区別して増幅する反応条件を決定できなかった。令和6年度、引き続き検討する予定である。以上が、「やや遅れている」理由である。
Strategy for Future Research Activity	リンゴ樹木にみられる黒星病斑は、外見上は一つの病斑でもシングルコロニーとは限らず、CYP51A1遺伝子型の異なる黒星病菌が混在している場合も多い。実際、令和5年度に行った研究においても、黒星病罹病葉の病斑に野生型とY133F型の混在やY133F型とM141I型の混在がみられた。令和5年度の研究成果として、ORNi-PCRによって黒星病斑におけるCYP51A1遺伝子の「野生型」と「いずれかの変異型」の判別が可能となった。しかし、「どの変異型か」の判別は現状ではORNi-PCRのみでは特定できず、ORNi-PCR増幅産物の塩基配列解析が必要である。そこで、今後は病斑に混在する複数のCYP51A1遺伝子型をORNi-PCRのみで特定できるよう、反応条件などを検討する予定である。また、より迅速にCYP51A1遺伝子型を判別するため、黒星病菌の胞子を直接ORNi-PCR反応液に添加して、CYP51A1遺伝子の変異型をORNi-PCRで検出可能かも検討予定である。