| Project/Area Number |
22K05672
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 39050:Insect science-related
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
藤原 亜希子 群馬大学, 食健康科学教育研究センター, 講師 (90726720)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
渡邊 和代 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, 契約研究員 (80835116)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
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| Keywords | タバココナジラミ / 共生細菌 / 菌細胞 / 細胞培養 / 吸汁性農業害虫 / 初代培養 / 機能解析手法 / 培養細胞 |
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| Outline of Research at the Start |
多くの吸汁性農業害虫が有する菌細胞共生系は、宿主昆虫と共生細菌が互いに不足する栄養素を補い合う生存・繁殖に必須のシステムであるが、その分子機構には未解明な点が多い。そこで本課題では、タバココナジラミ菌細胞を用いた効率的機能解析手法の開発を目的とする。まず菌細胞の長期安定維持培養法を確立し、ハイコンテント解析使用へと最適化する。さらに、タバココナジラミ菌細胞が有する高い増殖力に着目し、世界初の菌細胞由来の培養細胞株化にも取り組む。この培養細胞株樹立に成功し、さらにハイコンテント解析で使用できるようになれば極めて有用な実験系となり、様々な菌細胞共生系の分子機構の解明に繋がることが期待される。
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| Outline of Annual Research Achievements |
世界中の農作物に対して甚大な経済的損害を与える吸汁性害虫の中には、その体内に“菌細胞”と呼ばれる共生細菌を棲まわせるための肥大化した特殊な組織を持つものが多く存在する。宿主昆虫と必須共生細菌は、共に不足する栄養等を補い合っており、お互いの存在なしでは生存・繁殖が不可能であるという必須かつ特異的な相互作用関係にある。よって菌細胞共生系は、異なる生物同士が進化させた最密接な空間での共生様式として、古くから生物学や農学など幅広い分野における多くの研究者に注目されてきたが、必須共生細菌の単離培養ができないことや宿主昆虫に使用できる簡便かつ効果的な機能解析手法の不足から、その分子機構の多くは残念ながら未解明である。よって本課題は、具体的に「(I)タバココナジラミ菌細胞の長期安定維持手法の確立」、「(II)タバココナジラミ体細胞由来培養細胞株の樹立」、「(III)タバココナジラミ菌細胞由来培養細胞株の樹立」、「(IV)ハイコンテント解析(機能解析)使用条件の最適化」の４つの段階的な研究課題を設定して、タバココナジラミ菌細胞そのものを用いての、効率的な共生関連遺伝子の機能解析手法の開発を目指すものである。2023年度においては、昨年度に引き続き課題(II)および(III)を遂行するとともに、昨年度の課題(I)によって得られた結果(培養条件の最適化検討)をもとに課題(IV)の遂行に向けての手法および比較対象とする既存培養株の検討を行った。また、これまでに得られた成果について国内学会にて発表した [○渡邊和代(分担者)・粥川琢巳・藤原亜希子(代表者)「タバココナジラミ菌細胞のex vivo培養系の確立」第68回日本応用動物昆虫学会大会 (2024年3月28日-31日開催、仙台市]。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
課題(I)については昨年度の時点で培養７日後の菌細胞生存率約8割 (78.54 ± 2.129 %) となる培養条件の確立に成功したことから、今年度はさらにex vivo培養系としての改良を試みた。その結果、培養容器として96 well plateを使用し、1週間ごとに培養液 (Grace 20%FBS + glutamine 20mM + PVP 1mg/ml) の1/3を交換する手法により、最低でも2週間程度菌細胞を安定維持することに成功した。
課題(II)および(III)については、昨年度から引き続きタバココナジラミ胚子由来細胞を用いて、初発投入量等の条件検討をしつつ初代培養株の樹立を目指して培養を継続中である。
課題(IV)については、課題(I)にて得られた長期維持最適条件にて菌細胞への機能解析手法の最適化を行うにあたっての準備として、先行研究事例を参考にして対照実験用の培養細胞株の選定 [トランスフェクション効率が良い昆虫培養細胞として、NIAS-Bm-oyanagi2 (カイコガ胚組織由来)、NARO-Ossc-M8 (アズキノメイガ終齢幼虫脂肪体由来) ]、トランスフェクション試薬の選定 [TransIT-Insect (Mirus Bio社) および FuGene HD (Promega社)] を行った。さらに、試薬による菌細胞への導入効率が低い場合も想定して、追加でエレクトロポレーション法も検討するための準備を行った。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在の進捗状況を鑑み、課題(II)および(III)については引き続き行い、課題(IV)については虫体より回収した菌細胞を使用する方向性で遂行することとした。上記で記載したように、当初予定していた以外の遺伝子導入手法(エレクトロポレーション法等)についても積極的に検討事項として追加していくことにより、研究を推進していく。
また、本課題においては、研究対象としてタバココナジラミMED Q1遺伝型(殺虫剤抵抗性やウイルス媒介能力が高く、農業被害の大きい侵入系統)を用いてきたが、近年、新たにタバココナジラミMED Q2遺伝型が日本圃場にも定着し分布を拡大していることが判明 (現在査読中、プレプリント版は公開中：Fujiwara(代表者) et al. (2024) Prevalence, symbiosis with Rickettsia, and transmission of Tomato yellow leaf curl virus of invasive Bemisia tabaci MED Q2 in Japan：https://www.researchsquare.com/article/rs-3976000/v1)したことから、研究の発展のためにMED Q2遺伝型菌細胞についても対象に加えることを予定している。その準備として、未だゲノム情報のないMED Q2遺伝型の共生細菌2種(Portiera, Rickettsia)についての新規ゲノム配列決定、ゲノムアノテーション、GO解析、近縁共生細菌ゲノムとの比較解析についての支援を、第2期先進ゲノム支援2024年度支援課題公募に申請した。
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