| Project/Area Number |
22K05677
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 39050:Insect science-related
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
小林 淳 山口大学, 大学院創成科学研究科, 教授 (70242930)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
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| Keywords | 昆虫培養細胞 / 脱皮ホルモン / 細胞接着 / 脂肪体 / 細胞外マトリックス / スフェロイド / オルガノイド / 幹細胞 |
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| Outline of Research at the Start |
１. 脂肪体の特性を有する細胞集団の構成細胞の分離培養と特性解析
細胞集団に含まれる浮遊細胞および付着細胞を分離培養し、脂肪体幹細胞株の樹立を試みるとともに、増殖分化、各種昆虫ホルモンに対する応答、ウイルス感染などに伴う形態およびトランスクリプトームの時系列変化を解析し、基本特性を明らかにする。
２. 脂肪体オルガノイド形成技術の開発と特性解析
浮遊細胞と付着細胞を単独および共存状態で３次元培養し、脂肪体オルガノイドの形成に最適な細胞および培養条件の組み合わせを明らかにする。また、凝集体（スフェロイド）とオルガノイドの特性を比較し、脂肪体in vitro実験系としての実用性を検証する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
１. 脂肪体の特性を有する細胞集団の構成細胞の分離培養と特性解析
BoMo-Siam B のRNA-seqにより検出された高発現遺伝子上位5%（844個）の中に、カイコ5齢幼虫の脂肪体（FB）、中腸（MG）、マルピーギ管（MT）、卵巣（OV）、精巣（TT）、絹糸腺（SG）の6組織間で発現量に顕著な差異のある遺伝子が49個（FB：24個、MG：17個、MT：2個、OV：6個、TTおよびSG：0個）検出されたことから、BoMo-Siam Bには脂肪体だけでなく中腸など他の組織の特性を有する細胞も含まれており、細胞の形態的多様性からもヘテロな細胞集団であることが示唆された。
２. 脂肪体オルガノイド形成技術の開発と特性解析
BoMo-Siam B に脱皮ホルモン（エクジソンと20ヒドロキシエクジソン（20E））および幼若ホルモン（メトプレン）を培養液に添加したところ、20E処理区において、添加後2日目以降にスフェロイドの顕著な巨大化が観察された。添加後2日目の細胞のRNA-seqにより、20E処理によって発現量が2倍以上変化する遺伝子が1284個（増加：562個、減少：722個）検出された。そのうち発現が増加した遺伝子には、基底膜を構成する細胞外マトリックス分子のラミニンやコラーゲン、細胞接着に関与するカドヘリンやインテグリンなどが確認された。一方、減少した遺伝子には、コラゲナーゼが含まれていた。ただし、その後の qRT-PCR分析では、一部の遺伝子のホルモン応答が再現されず、20Eによる細胞接着効果にも変動が見られたことから、何らかの原因で20Eに対する反応性の低下が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
新たに樹立されたカイコの細胞集団について、詳細なトランスクリプトーム解析により脂肪体細胞だけでなく中腸などの特性を有する細胞も混在していることが確認され、さらに昆虫ホルモンの一つである20Eの添加により、細胞接着に関与する遺伝子発現の変動が起こり、スフェロイド形成が促進されること、並びに20Eに対する反応性の変動を明らかにできた。これらの知見から、今後のオルガノイド形成技術開発に重要な新知見と解決すべき課題が明白となり、研究計画に沿って着実に遂行できたと判断される。
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| Strategy for Future Research Activity |
１. 脂肪体の特性を有する細胞集団の構成細胞の分離培養と特性解析
ヘテロな増殖分化細胞集団BoMo-Siam Bおよび分離後の構成細胞のトランスクリプトームを20Eへの反応性も含めて比較解析する。また，カイコ核多角体病ウイルスなどの昆虫ウイルス感染性についても比較解析し、構成細胞の特性の異同を明らかにする。
2. 脂肪体オルガノイド形成技術の開発と特性解析
前項において20Eによるスフェロイド形成促進効果が最も高い構成細胞を用いて、20E投与量並びに他のホルモンの同時投与などによりオルガノイド形成の可能性を検証し，昆虫細胞のオルガノイド形成の基本技術開発を試みる。また，昆虫ホルモンにより形成促進されたスフェロイドあるいはオルガノイドのトランスクリプトームや、カイコ核多角体病ウイルスなどの昆虫ウイルス感受性を明らかにし，脂肪体などの生体組織と比較することにより，in vitro実験系としての実用性を検証する。また，将来の有用物質生産や食資源などの新規利用技術開発への応用の可能性についても検討する。
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