Characteristic approach in hemicellulase which is important for biodegradation of woody biomass.

• Project/Area Number: 22K05762
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 40020:Wood science-related
• Research Institution: Shinshu University
• Principal Investigator: 天野 良彦 信州大学, 学術研究院工学系, 教授 (80273069)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 田川 聡美 信州大学, 工学部, 助教(特定雇用) (20911952) ; 殿塚 隆史 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (50285194) ; 水野 正浩 信州大学, 学術研究院工学系, 准教授 (60432168)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000); Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
• Keywords: バイオマス / へミセルロース分解酵素 / 基質特異性

Outline of Research at the Start

木質バイオマスの酵素糖化を考えるうえで、自然界でその分解に重要な役割を担っている担子菌類の生産する酵素の機能を解明し、適切に利用することが肝要である。特に、ヘミセルロースの分解に焦点を当てた研究の進展が木質バイオマスの酵素糖化の効率化の鍵を握ると考えている。本研究では、広葉樹及び針葉樹のヘミセルロースを効率的に分解する酵素のメカニズムの解明を目標に、酵素の基質特異性の差異と酵素の立体構造の相関解析を行う。特に、分解の難しい針葉樹に多く含まれるマンナン分解の効率化にスポットを当て、これの分解酵素の基質特異性に迫る。最終的には、木質バイオマス分解におけるヘミセルラーゼの利用戦略の構築に貢献する。

Outline of Annual Research Achievements

令和4年度は天然型基質を調製すると共に、市販の基質を用いた基質特異性の違いを明らかにする予定としていた。また、基質特異性の違いの鍵となる酵素の立体構造を明らかにすることを計画した。そのため以下の各項目について実験を進めた。
① 針葉樹（スギ、カラマツ）由来の天然型マンナン系基質調製：イオン液体抽出法により修飾基との共有結合を保持した基質を調製する方法について試みており、その構造を解析中である。② ４種の菌由来のファイミリ―５に属する９種類の酵素の基質特異性の解明：遺伝子組み換えによる酵素の調整を行い、その一部について基質の特異性の解明を行った。③ 精製酵素の結晶化：得られた酵素の結晶化キットによる結晶の作成し、解析可能な闕所を得ることができた。④ X 線回折による立体構造の解析：高エネルギー研究所のビームラインを使って立体構造の解析を行った。
以上の実験により、β-1，4結合の切断の選択性は高いものの、構成糖についてグルコースであるか、マンノースであるかの点においてはその認識があいまいな酵素が存在することを明らかにすることができた。引き続き構造面からその違いを明らかにするように継続して実験を行っている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

4種の菌類由来のCEL5酵素を調整し、その性質を比較してきている。Talaromyces cellulolyticus由来の分子量33000の糖質加水分解酵素ファミリー5 (GH5) 耐熱性グルコマンナン (GM) 分解酵素TcCel5Bを単離し、その性質を明らかにした。また、Irpex lacteusの生産する4種のCel5を遺伝子組換え発現し、その性質の一部を明らかにした。その中でも次の酵素についてそのユニークな性質を明らかにすることができた。TcCel5Bは、40 °C条件においてβ-1,4-結合のみを分解し、β-1,3-結合とβ-1,6-結合は分解せず、キチンやキトサン、キシランも分解しなかった。次に、立体構造から多基質特異性の要因を調べるため、TcCel5Bの結晶を作成し、X線結晶構造解析によりTcCel5Bについて1.8 Å分解能での三次構造を決定した。また、温度条件を変えたときの基質特異性について、40 °Cにおけるカルボキシメチルセルロース (CMC) 基質に対する活性が181 U/mgである一方で、GM基質に対する活性が 51.1 U/mgとCMC基質に対する活性が高かった。しかし、80 °CにおいてはGM基質に対する活性が 423 U/mgである一方、CMC基質に対する活性が 278 U/mgとGM基質に対する活性が高かった。40 °Cから80 °Cでの活性変化をみると、CMCは154 %、GMは838 %となった。以上の結果から、TcCel5Bはβ-1,4-グルコシド結合及びマンノシド結合を認識することが示され、TcCel5Bの基質特異性には温度依存性があることが示唆された。実験結果と構造解析から、TcCel5Bの多基質特異性と耐熱性が相互に関係していることが示唆された。

Strategy for Future Research Activity

令和5年度は、天然型の基質を用いた基特異性の差異の把握と、酵素の立体構造からみた、特異性の要因となる構造を明らかにする。そのため主に、以下の課題に取り組む予定としている。
①針葉樹（スギ、カラマツ）由来の天然型マンナン系基質調製：抽出した多糖類の酵素による断片化と断片のMALDI TOF-MS分析、② ４種の菌由来のファイミリ―５に属する９種類の酵素の基質特異性の解明：天然からの基質を用いた酵素の基質特異性の解析、③ 精製酵素の結晶化：共結晶の作成と部位特異的による変換酵素の作成、④ X 線回折による立体構造の解析：立体構造解析と、既発表の類似した酵素の構造比較。
これらの課題から、酵素の基質特異性の厳密さと曖昧さの違いを明らかにしていく予定である。