Research for anti-termite chemicals using terpenoids produced by fungal cytochrome P450monooxygenase recombinant yeast.

Research Project

Project/Area Number	22K05778
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 40020:Wood science-related
Research Institution	Miyazaki Prefectural Wood Utilization Research Center
Principal Investigator	須原弘登宮崎県木材利用技術センター, その他部局等, 副部長 (90423540)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	一瀬博文九州大学, 農学研究院, 准教授 (00432948) 加藤政和宮崎県木材利用技術センター, 材料開発部, 技師 (90966582)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000) Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Keywords	木材保存処理 / シロアリ / テルペン / セスキテルペン合成酵素 / シトクロームP450 / シロアリ防除 / 木材劣化 / 遺伝子組み換え
Outline of Research at the Start	一般的に『精油』として知られるテルペン類の中には、α-cadinolやsandaracopimarinol、16-phyllocladanolのように殺蟻活性や抗蟻（摂食抑制）活性を示すものがあることが知られている。一方で、精油は生産量が僅かである場合が多く、多種のテルペンの混合物として得られるため、テルペンの機能性を生かした防蟻処理についてはあまり研究が進んでいない。本研究では糸状菌のSTS及び様々な化合物に対して代謝能を持つ糸状菌のCYP遺伝子を酵母に導入しテルペン類の生産・代謝を行い、これにより生産されたテルペンを用いて防蟻性能試験を行うことで、天然物であるテルペンまたはその生物変換物による防蟻処理技術の開発を目指す
Outline of Annual Research Achievements	本研究では真菌類の持つ多様な代謝能に着目し、そのうち抗蟻活性が多く報告されているテルペン類を生産・代謝可能な遺伝子の機能を利用して、新規な抗蟻性テルペンを発見することを目標としている。そのために、セスキテルペンを合成可能なセスキテルペン合成酵素（STS）とこれを代謝可能なシトクロームP450（CYP）の遺伝子をライブラリ化したものを酵母に組み込み、テルペンを合成・代謝させ、これにより得られたテルペンの抗蟻性を評価する。昨年度の検討では、STS遺伝子ライブラリを用いた研究に取り組み、11クローンのSTS遺伝子より生合成されるセスキテルペンを用いて抗蟻性能評価を行ったが、シロアリ虫体を充分に確保できないなどの問題があり、繰り返し評価までは至らなかった。そのため、今年度も引き続きSTS遺伝子産物の評価に注力した。テルペン生産能の高い13クローンについてテルペン生合成を行い各3回ずつの抗蟻性能評価行った。試験では対照として用いたフェルギノールの食害率が無処理区に対して再現性良く抗蟻性を示し食害率が10.1% （n=6）まで低下したのに対して、クローン産物のセスキテルペンでは試験結果が大きくばらつき、抗蟻性を評価することが難しい結果となった。この中でPpSTS-14とAvSTS-01が複数回の試験で高い食害抑制効果を見せた。この二つのクローンの代謝物はいずれもiltremulanol Aであることから、再現性の確認は必要であるが、食害抑制効果を持つ可能性があると考えられた。また、入手が容易でフェルギノールに類似した構造を持つアビエチン酸（マツヤニの主成分）をCYPで変換して得られた代謝物についても抗蟻性能評価を行ったが、アビエチン酸のCYP代謝物では、抗蟻性が低下する結果となった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason 本課題では糸状菌が有するSTS、CYPをライブラリ化したものを用いて、STSによりセスキテルペン合成を、CYPによりSTSが生産したセスキテルペンまたは天然物由来のテルペンを代謝させたものを用いて防蟻性能を評価することを目的としている。今年度は初年度で注力したSTS遺伝子のみを用いて生合成したセスキテルペンの抗蟻性評価が再試まで至っていなかったために、この再試に取り組み13クローンの産物の防蟻性能評価に取り組むことができた（繰り返し含む）。しかしながら、試験結果は再現性が低く防蟻性能を評価することが難しいものであった。対照として用いた防蟻効果のあるジテルペンのフェルギノールでは再現性良く防蟻効果が見られているため、STS産物のセスキテルペンでは揮発の影響により効果の再現性が低くなっている事が考えられた。そのため、試験方法の見直しが必要であると考えられた。別途行ったジテルペンのアビエチン酸とそのCYP代謝物を用いた試験では再現性のある結果が得られていることも、この考察を支持している。 STS産物の評価の再現性が得られないため、当初よりも研究が大きく遅れており、最終年度の次年度では、早急にSTS産物の評価方法を見直して、再試を行うとともに、併せて当初計画で予定していたCYPクローンを用いたテルペン代謝物の評価も進める必要がある。
Strategy for Future Research Activity	13のSTSクローンを用いた試験では再現性の低さが問題となった。セスキテルペンの沸点を鑑みて試験体となるテルペンを吸着したろ紙の乾燥を105℃、5分で行っていたのだが、短時間の処理であってもセスキテルペンが揮発していた可能性があるため、試験体の乾燥方法を見直し、早急に再試に取り組みたい。STSクローンについてはテルペン生産能が高いものについてはおおよそ網羅したため、最終年度となる次年度はSTS遺伝子とCYP遺伝子の共発現により、セスキテルペンを部分的に代謝させたものを生産し、防蟻性能試験を行う。これにより防蟻性能を付加または強化できる可能性がある。また、当研究室ではスギ由来の精油やフェルギノールを主な成分とする樹脂等を有しており、特に樹脂成分からは複数のテルペンの単離・精製を行っていることから、これらのテルペンをCYPクローンライブラリを用いて代謝を試み、その代謝産物の防蟻性能評価を行いたいと考えている。この検討では、天然物として得ることが難しい中間代謝物を得ることができる可能性があり、これらの防蟻性能を評価することで代謝による防蟻性能の変化を推定できる可能性や、防蟻効果の高いテルペンを得ることができる可能性がある。試験の数が多くなるため、シロアリ虫体の確保が重要となることから、試験地の調査頻度を増やし、シロアリの探索と確保に努めたい。