| Project/Area Number |
22K05818
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
|
| Allocation Type | Multi-year Fund |
|---|
| Section | 一般 |
|---|
| Review Section |
Basic Section 40040:Aquatic life science-related
|
|---|
| Research Institution | Tokyo University of Marine Science and Technology |
|---|
Principal Investigator |
二見 邦彦 東京海洋大学, 学術研究院, 准教授 (00513459)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
片桐 孝之 東京海洋大学, 学術研究院, 准教授 (50361811)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
|
| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
|
| Budget Amount *help |
¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
|
|---|
| Keywords | p16 / SASP / SA-β-gal活性 / 完全老化 / 魚類細胞 / 細胞老化 |
|---|
| Outline of Research at the Start |
ヒト正常二倍体細胞は，培養を続けるうちに老化して分裂を停止し，最終的には死滅してしまう。一方，魚類由来培養細胞の多くは，癌化や形質転換の形跡がないにも関わらず容易に株化し，また分裂寿命や細胞老化の兆候が見られないという，特異な性質を持っている。しかしながら，その老化耐性のメカニズムは40年以上にわたって謎であった。
本研究では，魚類由来培養細胞がどのようにして完全老化に対する耐性を維持しているのか，魚類には「ない」遺伝子の導入により魚類由来培養細胞の完全老化誘導を試みることで，その分子メカニズムを解明する。
|
| Outline of Annual Research Achievements |
哺乳類では，癌遺伝子産物Rasはp53経路とp16経路の両方を活性化することで細胞老化を誘導する。魚類はp16を欠如しているため，Rasの活性化のみでは魚類細胞は完全老化に成熟できない。そこで本研究では，魚類には「ない」p16遺伝子とras遺伝子を魚類由来培養細胞株EPCに共導入し，完全老化誘導を試みることで，その老化耐性メカニズムを解明することを目的とした。
ヒトp16を単独でトランスフェクションしたEPC細胞において，細胞老化マーカーであるSA-β-gal活性の上昇と，SASP（細胞老化随伴分泌現象）因子をコードする遺伝子（il1b，il6，cxcl8a）の発現上昇が確認された。申請前に行った予備実験では，p16を単独で導入した細胞ではSASP因子の発現上昇は確認できなかったが，これは，選択用抗生物質G418によるセレクションが行われていなかったため，一過性の導入ではp16を発現する細胞が少なかったことが理由であると推察された。
次に，市販のバイシストロン性発現プラスミドベクター（pIRES）およびバイディレクショナル発現ベクター（pBI）を用いてp16 とドミナントネガティブ変異体Ras（RasN17）を同一プラスミドから翻訳させるシステムの構築を試みた。その結果，魚類細胞ではIRESは機能せず，ColE1 oriを持つpBIはpUC oriを持つpIRESに比べてコピー数が少なく，トランスフェクションに十分な量のプラスミドを抽出できなかった。
少なくとも魚類のゲノムにp16が存在しないことが魚類の細胞株が完全老化に対して耐性をもつことの重要な決定要因の一つではあるものの，p16によって誘導される完全老化にRasの活性化が必要どうかについては明らかにできなかった。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
申請者らはこれまでに，ヒトの細胞老化において中心的役割を担うras癌遺伝子が，魚類では細胞の初期老化に寄与するのみで，Rasの活性化だけでは完全老化には成熟しないことを見出していた。そこで，ヒトには「ある」が魚類には「ない」老化関連遺伝子p16を魚類由来培養細胞株EPCにトランスフェクションしたところ，細胞老化マーカーであるSA-β-gal活性の上昇と，SASP因子をコードする遺伝子（il1b，il6，cxcl8a）の発現上昇が確認された。申請前に行った予備実験では，p16を単独で導入した細胞ではSASP因子の発現上昇は確認できなかったが，これは，選択用抗生物質G418によるセレクションが行われていなかったため，一過性の導入ではp16を発現する細胞が濃縮されていなかったことが理由であると推察された。
申請者らは，①哺乳類p16遺伝子の安定発現株の作製と，②p16とドミナントネガティブ変異体ras（rasN17）の共導入を試みた。予備実験では， p16 とrasN17の両方が同じ細胞に導入される確率が低かったため，市販のバイシストロン性発現プラスミドベクター（pIRES）およびバイディレクショナル発現ベクター（pBI）を用いてmCherry（赤色蛍光）融合p16とAcGFP1（緑色蛍光）融合RasN17を同一プラスミドから翻訳させるシステムの構築を試みた。その結果，①哺乳類p16遺伝子を恒常的に発現する細胞は細胞老化により不可逆的に増殖が停止してしまうため，安定発現株の作製が困難であり，また，②魚類細胞ではIRESは機能せず，ColE1 oriを持つpBIはpUC oriを持つpIRESに比べてコピー数が少なく，トランスフェクションに十分な量のプラスミドを抽出できなかった。そのため，p16によって誘導される完全老化にRasの活性化が必要どうかについては明らかにできなかった。
|
| Strategy for Future Research Activity |
令和4年度までに，p16遺伝子をもたないことが魚類細胞の老化耐性機構の重要な要因であることを明らかにした。令和5年度以降は，p16以外の考えられる要因として，魚類には「ない」核内構造体であるPML（前骨髄球性白血病）ボディや，ミトコンドリア機能との関連にも着目する。
ヒト正常二倍体線維芽細胞IMR90において，PMLボディは，SAHF（細胞老化特異的ヘテロクロマチン構造）など，老化した細胞における特定のクロマチンの構造的特徴の形成に関与していることが示されている。PMLボディを構成するPMLタンパク質にはいくつかの異なるスプライシングバリアントが存在するが，そのうちの一つであるPML IVの過剰発現は，ヒト線維芽細胞において細胞老化を誘導することが報告されている。そこで，mCherry融合PML IVを発現するプラスミドを構築し，EPC細胞へのトランスフェクションを行い，SA-β-gal活性および各種老化マーカーの解析を行う。
また，魚類と同様にp16遺伝子を欠くショウジョウバエでは，Rasの活性化とミトコンドリアの機能障害によりJNKの活性化とHippo経路が抑制され，完全老化の指標であるSASPが誘導される。魚類においてもJNK経路とHippo経路は保存されているため，EPC細胞におけるこれらの経路を介したSASP制御についても明らかにする。なお，ショウジョウバエの研究では，ミトコンドリア呼吸鎖複合体遺伝子の機能欠失変異体の上皮細胞が用いられていたが，魚類での変異体作出は困難なため，本研究では脱共役剤CCCPや呼吸鎖複合体III阻害剤アンチマイシンAなどのミトコンドリア阻害剤をEPC細胞に添加することで対応する。ミトコンドリアの機能障害はJC-1染色により確認する。また，mCherry融合RasN17のトランスフェクションにより，Rasとのかかわりについても明らかにする。
|
