| Project/Area Number |
22K05822
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 40040:Aquatic life science-related
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
天野 勝文 北里大学, 海洋生命科学部, 教授 (10296428)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
阪倉 良孝 長崎大学, 水産・環境科学総合研究科(水産), 教授 (20325682)
高谷 智裕 長崎大学, 水産・環境科学総合研究科(水産), 教授 (90304972)
山本 直之 名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (80256974)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
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| Keywords | フグ毒テトロドトキシン / フグ毒結合タンパク質 / 脳 / 下垂体 / フグ毒 / フグ |
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| Outline of Research at the Start |
フグはフグ毒（テトロドトキシン；TTX）を含む餌を摂取して毒化する．我々は，有毒フグの脳内にTTXが存在することを発見し，さらにTTXがフグ脳内で重要な生理機能を果たすことを提唱した．定説ではTTXは脊椎動物の血液脳関門を通過しないとされるが，摂餌で取り込んだTTXをフグが脳に蓄積する事実は，この定説を覆す機構をフグが有することを意味する．通常，TTXはフグ毒結合性タンパク質（PSTBP）と結合して有毒部位に運ばれる．我々は最近，有毒トラフグ稚魚の脳内の血管にPSTBPを認めた．本研究では，「TTXはPSTBPと結合することで血液脳関門を通過して脳に入り生理機能を発揮する」との仮説を検証する．
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| Outline of Annual Research Achievements |
[実験１．トラフグ中枢神経系におけるPSTBPの分布] トラフグのフグ毒結合タンパク質（PSTBP）に対するウサギポリクローナル抗体を長崎大学水産学部より供与された．養殖トラフグ稚魚（フグ毒テトロドトキシン（TTX）含有餌を経口投与したTTX投与群と無毒餌を経口投与した対照群の２群）の頭部をブアン液固定後，パラプラスト包埋した．ミクロトームで薄切切片を作製し，脳と下垂体におけるPSTBPの分布を免疫組織化学染色で調べた．その結果，PSTBP免疫陽性反応は，両群において下垂体中葉に相当する領域に検出されたが，脳内には検出されなかった．
[実験２．トラフグ中枢神経系におけるTTXの分布] 実験１においてPSTBP免疫陽性反応が下垂体に検出されたことから，中枢神経系におけるTTXの分布についても抗TTXマウスモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学染色で調べた．その結果，TTX投与群のみでTTX免疫陽性反応が下垂体神経葉に相当する領域，終脳腹側部の下部の領域および視神経に検出された．
[実験３．トラフグ中枢神経系におけるPSTBPとTTXの分布] トラフグ中枢神経系におけるPSTBPとTTXの組織学的関係の有無を調べるために，実験１・２のサンプルを用いて，それらの分布を二重免疫組織化学染色で調べた．TTX投与群ではPSTBPとTTXは下垂体において近接して検出されたことから，両者の生理学的な関連性が示唆された．
[実験４．トラフグ中枢神経系におけるPSTBP遺伝子発現] PSTBP前駆体の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いて逆転写PCR(RT-PCR)を行い，トラフグ中枢神経系におけるPSTBP遺伝子発現の有無を調べた．まず．肝臓でのPSTBPの特異的な発現を確認した．PSTBPの発現は，TTX投与の有無にかかわらず，脳では全個体で，下垂体においては約半数の個体で検出された．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和４年度は，養殖トラフグ稚魚においてPSTBPが下垂体に存在すること，およびTTX投与群ではPSTBPとTTXは下垂体において近接して存在することを明らかにできた．PSTBP遺伝子発現は肝臓の他に脳と下垂体でも検出されたが，免疫組織化学染色では脳には検出されなかった．TTX免疫陽性反応は下垂体神経葉に相当する領域，終脳腹側部の下部の領域および視神経に検出されたことから，餌とともに摂取したTTXが終脳腹側部の下部を通過して下垂体に到達したと考えられるが検討が必要である．さらに，TTXはPSTBPと結合した状態で血管中を輸送されると考えられているが，この点についても検討が必要である．フグ科魚類の下垂体におけるTTXの存在を免疫組織化学染色で示した報告例は初めてと考えられる．TTXは下垂体において下垂体ホルモンの分泌にも関与する可能性がある．
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| Strategy for Future Research Activity |
養殖トラフグ稚魚で得られた知見が天然の有毒フグについても当てはまるか否かを検討する．予備的実験では，神奈川県江の島で釣獲したクサフグの下垂体においても，二重免疫組織化学染色でPSTBPとTTXが検出されたので，さらに個体数を増やして詳細に調べる．肝臓の毒性も測定し，毒性との関連についても考察する．
養殖トラフグ稚魚にTTXを経口投与すると，下垂体神経葉に相当する領域，終脳腹側部の下部の領域および視神経にTTXが検出された．TTXはPSTBPと結合して輸送されると考えられるが，脳内にはPSTBP免疫陽性反応が検出されなかったことから，用いた抗PSTBP抗体はTTX-PSTBP結合物質を認識しないことも考えられる．そこで，PSTBPの機能について，PSTBPを保有しない魚類のメダカを材料にして検討する．メダカに致死量以下の低濃度のTTXを経口投与し，魚体全体を免疫組織化学染色に供してTTXが下垂体に検出されるか否かを調べる．
養殖トラフグ稚魚のTTX投与群では下垂体にTTXが検出されたことから，TTXが下垂体ホルモンの分泌に関わる可能性がある．そこで，TTX投与群と対照群における下垂体ホルモンの遺伝子発現量をRT-PCRで調べて検討する．
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