| Project/Area Number |
22K05939
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 41050:Environmental agriculture-related
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| Research Institution | Health Sciences University of Hokkaido |
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Principal Investigator |
堀内 正隆 北海道医療大学, 薬学部, 准教授 (90322825)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
永田 崇 京都大学, エネルギー理工学研究所, 准教授 (10415250)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2025: ¥390,000 (Direct Cost: ¥300,000、Indirect Cost: ¥90,000)
Fiscal Year 2024: ¥260,000 (Direct Cost: ¥200,000、Indirect Cost: ¥60,000)
Fiscal Year 2023: ¥650,000 (Direct Cost: ¥500,000、Indirect Cost: ¥150,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000)
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| Keywords | ハイブリッド酵素 / セルラーゼ / セルロース / 好冷菌 / タンパク質工学 / グルコース生産 / 結晶性セルロース |
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| Outline of Research at the Start |
エタノールは、持続可能性をもつ代替燃料として注目されており、その原料となるグルコースを、バイオマスから低コストで生産するシステムの開発が急がれている。北海道などの低温地域は、豊富なバイオマス資源を有するが、既存の高温型酵素を利用したグルコース生産法では、加温コストが事業化の障壁となることから、低温地域に最適化された低温型グルコース生産技術が必要である。本研究では、氷温でバイオマスを分解することのできる好冷菌型ハイブリッドセルラーゼを開発し、低温地域に最適化された革新的グルコース生産システムを創成する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
令和5年度は、低温型ハイブリッドセルラーゼの酵素ユニットのうち、セルロース線維にニックを入れる作用をもつと考えられる、Sclerotinia borealisのグリコシドハイドロラーゼファミリー12 (sbEG3) のクローニングおよび組換えタンパク質の発現を試みた。S. borealisのゲノムには2種類のsbEG3候補遺伝子が存在していたが、取得済のcDNAライブラリーから増幅できたのは1種類だけであった (以下、sbEG3Bとする)。増幅されたsbEG3Bにはさらに2種類バンドが確認され、配列分析の結果、一方はオルタナティブスプライシングにより、構造ドメイン領域よりC末端の配列が欠質しており、より低分子量の酵素となることが予想された。次に、Pichia pastorisおよびBrevibacillusを宿主として、sbEG3B組換えタンパク質の生産を試みた。その結果、Brevibacillusにおいてのみ、sbEG3Bの培地中への分泌発現を確認することができた。
発現したsbEG3Bは、C末端側に付加したHis-tagを利用して、Niキレートカラムによりアフィニティー精製した。この精製物による、結晶性セルロースAvicel PH-101に対する分解活性を調べたが、現在のところ、明確な分解活性を観測することはできていない。今後は、分解により適した短かいオリゴ糖などを基質として、活性測定を試みる予定である。
また、酵素ユニットに利用できる他の酵素遺伝子として、S. borealisのセロビオハイドロラーゼ1 (sbCBH1)のクローニングも開始した。その結果、現時点において、2種類のsbCBH1候補遺伝子のクローニングに成功しており、現在、その組換えタンパク質の発現を複数の宿主を用いて検討中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ハイブリッド酵素の酵素ユニットの個別生産のうち、当初2年間に実現すべき2種類のうち、2種類目の生産に成功し、ハイブリッド酵素生産の準備が整ったたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、ハイブリッド酵素のすべての酵素ユニットの個別生産を完了して、それぞれの酵素活性を測定する。活性が確認できた酵素ユニット同士を、遺伝子工学的あるいはタンパク質化学的に接続したハイブリッド酵素を作製するとともに、個々の酵素ユニットについては、結晶化あるいはNMRによる立体構造解析に向けた準備を進めていく。
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