微量の肝細胞から長期培養可能な犬の人工肝臓を作出する

Research Project

Project/Area Number	22K06014
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 42020:Veterinary medical science-related
Research Institution	Azabu University
Principal Investigator	根尾櫻子麻布大学, 獣医学部, 講師 (50532107)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2024: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000) Fiscal Year 2023: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000) Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Keywords	犬 / 人工肝臓 / 薬物代謝 / 質量分析 / 肝細胞 / 長期培養 / 代替法
Outline of Research at the Start	わずか1g以下の微量の肝臓組織から長期培養可能な犬の人工肝臓作製の基盤技術を開発する。犬では、人に類似した肝炎や肝硬変といった難治性肝疾患が多く発生するため、ごく微量な犬肝組織から人工肝臓を作出できると、病態解析や治療薬の開発が進む。方法として、採取した肝組織から肝細胞を誘導し、肝細胞周囲組織に存在する細胞群と共に培養して細胞凝集塊（スフェロイド）を作製する。最終的にスフェロイドを3Dプリンターで積層し、生体内環境を長期間再現する実用性の高い犬人工肝臓を作出することを目的とする。本研究の成果は、多くの肝疾患の症例で病態解明や新規治療薬の探索を可能とし、創薬プロセスの迅速化に大きく貢献する。
Outline of Annual Research Achievements	わずか1g以下の微量の肝臓組織からでも長期培養可能な犬の人工肝臓作製の基盤技術を開発することが本研究の目的である。犬では、人に類似した肝炎や肝硬変といった難治性肝疾患が多く発生している。すなわちごく微量な犬肝組織から人工肝臓を作出できると、病態解析や治療薬の開発が進む。その方法として、採取した肝組織から肝細胞を誘導し、肝細胞周囲組織に存在する細胞群と共に培養して細胞凝集塊（スフェロイド）を作製する。最終的にスフェロイドを3Dプリンターによって積層し、生体内環境を長期にわたり再現できる実用性の高い犬人工肝臓を作出することを目的とする。本研究の成果は、多くの肝疾患の症例で病態解明や新規治療薬の探索を可能とし、創薬プロセスの迅速化に大きく貢献する。 2022年度は、犬人工肝に関する肝薬物代謝機能の評価系構築に関して、質量分析装置を用いて肝臓の代謝機能を測定することに着手し、2023年度はその方法を確立するための方法を検討した。具体的には、スフェロイドの作製に成功している正常臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)、脂肪由来幹細胞(ASC)とイヌ肝細胞を用いてスフェロイドを作製し、そのスフェロイドと犬肝細胞の平面培養における代謝能の比較を行った。スフェロイドおよび平面培養犬肝細胞に関しては、肝細胞の薬物代謝における第一相反応の酵素であるチトクロムP450(CYP)が代謝することが報告されているテストステロンを100uMまたは50uMの濃度で添加し、0、４，8時間後に培養上清を回収した。各培養上清は、質量分析装置にてテストステロンとテストステロンが代謝された場合に出現するヒドロキシテストステロンの濃度を測定した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason スフェロイドおよび平面培養イヌ肝細胞に関して、フェノバルビタールを用いてCYP誘導を試み、誘導群と非誘導群で定量的PCRおよび質量分析を行った。定量的PCRでは、犬で薬物代謝に関連していると考えられるCYP3A12の発現量を検討し、培養4日目よりも7日目で、またPB誘導群で非誘導群よりもCYP3A12の発現量が増加することを確認した。質量分析では、培養7日目に、(1)PBの至適濃度（100uM, 1mM）、(2)テストステロンの至適濃度、また、(3)テストステロン添加後の回収最適時間の検討を行った。その結果、培養7日目でスフェロイドおよび平面培養犬肝細胞において代謝活性能があることが分かった。また、スフェロイドも平面培養イヌ肝細胞もフェノバルビタール非誘導群と比較して、誘導群ではヒドロキシテストステロンの量が増加することが分かった。このことから、スフェロイド、平面培養イヌ肝細胞ともにCYP代謝活性能を検討する際に、フェノバルビタール誘導は必須であると考えられた。さらに、(1)に関しては、スフェロイドではあまり差はなかったが、平面培養犬肝細胞においては、PB濃度依存性にテストステロン代謝活性が増加した。ケトコナゾールによる活性阻害効果も検討したが、今後の検討が必要であると思われた。(2)に関しては、現時点では、スフェロイドも平面培養イヌ肝細胞も至適濃度は100uMと考えている。(3)に関しては、8時間後が最も回収量が高いことが分かった。質量分析に関しては今後も継続して検討が必要であると考えている。
Strategy for Future Research Activity	薬物代謝機能に関しては、現在はテストステロンを用いてCYP活性の有無を検討しているが、その後、アセトアミノフェン、ミタゾラムなどの薬物を人工肝に添加し、動態を検討する。採取的に、平面培養の犬肝細胞のみならず、スフェロイド、さらに、スフェロイドを３Ｄプリンターで積層して作成する犬人工肝におけるにおける薬物を投与する際に必須となる薬物代謝評価系を確立する基盤技術を構築したい。３Dプリンターで積層するために最適なスフェロイドロイドを作製し、さらに長期間人工肝が生存を維持するためには、　肝細胞周囲組織との共培養および酸素の供給やアポトーシスの抑制が有効と考えられる。次年度は、犬の肝細胞を生体から得る方法を構築する予定である。肝臓の中には、組織幹細胞を含むと考えられている肝内胆管細胞や、肝細胞を用いて肝細胞周囲組織と共培養して生体外肝に最適なスフェロイドを作製する。これらのスフェロイドに関しては、細胞内ATPレベルを測定して生存率の指標とし、肝細胞のアルブミン発現量を定量的PCRで評価し、長期生存に最適な環境を検討する。人工肝臓の性状は、組織学的評価（光学顕微鏡、電子顕微鏡）に加えて、肝細胞特異的マーカー（AFP, アルブミン, HNf4a, CK18, CK19）と犬で報告されているCYP3A12, CYP2E1を含めて9つのCYP450s（Shou et al., 2003）発現を遺伝子およびタンパクレベルで詳細に解析することで肝細胞の性状を確認する。