マウス卵巣体外培養モデルを用いた卵母細胞選抜機構の解明

• Project/Area Number: 22K06041
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 42030:Animal life science-related
• Research Institution: Shinshu University
• Principal Investigator: 諸白 家奈子 信州大学, 学術研究院農学系, 助教 (90815250)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
• Keywords: reconstructed ovary / 卵母細胞 / 体外培養

Outline of Research at the Start

本研究では、有用家畜増産のための卵母細胞の体外利用や、卵母細胞数減少による早期閉経等のヒト不妊の原因解明を目指し、我々がこれまでに開発してきた卵巣の体外培養技術を用いて、卵巣内に存在する卵母細胞の発育を連続的に観察しながら、哺乳動物の卵子の発生・形成過程でどのような資質をもつ卵母細胞が発育を開始するのか、また、発育過程で死滅する卵母細胞はどのような特徴をもつのかを明らかにすることを目的とする。

Outline of Annual Research Achievements

哺乳類の卵巣内には数千～数万個の卵母細胞が存在するが、排卵まで生き残る卵母細胞と死滅する卵母細胞はどのようにして決定されるのか詳細は明らかになっていない。そこで、我々がこれまでに開発した体外卵巣培養系を生体内の現象を体外で解析するライブセルイメージング技術に応用することを目的として、令和5年度は、シスト不完全崩壊モデルで培養して得られたMOF(Multiple oocytes follicle)内の個々の卵母細胞が発育能をもつのか確認するための卵巣再構築培養技術の検討を行なった。これまでに、MOFでは卵胞発育の途中で卵母細胞が死滅していくことがわかっているが、MOF内の個々の卵母細胞が正常な質を有しているのか分かっていない。加えて、発育を開始した一次卵胞由来卵母細胞を卵胞から取り出し単独で培養する技術は、開発されていない。そこで今回、一次卵胞由来卵母細胞を多く含む卵巣を用い、再構築培養技術を応用することが可能か検討を行なった。この再構築培養技術は卵母細胞と体細胞を分離・再凝集したのち、凝集塊を培養することで卵母細胞を発育させる技術である。これまでに、卵巣の再構築培養の詳細な検討はほとんど報告されていないことから、我々は各発育時期の卵巣を再構築培養し、卵母細胞および卵胞の発育能を解析した。その結果、生後10日齢までの卵巣では発育卵胞である二次卵胞まで発育させることが可能だが、離乳期卵巣では再構築培養による卵胞形成・発育は困難であることが示唆された。次年度はこの技術を応用してMOF由来卵母細胞の発育能を解析する。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

目的とする遺伝子組換えマウスの系統樹立に至らなかったことから、遺伝子組換えマウス由来の卵巣を体外培養しながら、シスト不完全崩壊モデルにおける細胞内小器官が移動する現象を解析する実験計画に遅れが生じている。

Strategy for Future Research Activity

2024年度は、引き続き遺伝子組換えマウスの作製実験に取り組み、遺伝子組換えマウスの系統が樹立し次第、体外卵巣培養技術を用いてライブセルイメージングにより、シスト不完全崩壊モデルにおける細胞内小器官の移動を解析する。
また、生き残る卵母細胞と死滅する卵母細胞を決定するメカニズムを明らかにするため、胎子期から出生前後の卵母細胞シストにおけるミトコンドリアDNA (mtDNA) の変異に着目し、mtDNAの変異率が卵母細胞の発達に伴いどのように変化するのかqPCRとDNAシークエンス解析等を行う。