| Project/Area Number |
22K06047
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 42030:Animal life science-related
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
江島 耕二 北里大学, 理学部, 教授 (30327324)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小寺 義男 北里大学, 理学部, 教授 (60265733)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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| Keywords | 細胞傷害性T細胞 / 傷害顆粒 / Nkg7 / 細胞傷害 |
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| Outline of Research at the Start |
細胞傷害性細胞は，パーフォリンなどの細胞傷害分子を含む傷害顆粒の中身を標的細胞の方向へ放出することにより標的細胞を傷害する。しかし，傷害顆粒の放出や生合成の制御機構については未だ不明な点が多い。本研究では，最近我々が傷害顆粒の制御に必須であることを明らかにした4回膜貫通型の傷害顆粒膜分子Nkg7について，その機能の解明を目指す。具体的には，Nkg7の傷害顆粒内側のループ部位や細胞質内C末端部位の一部をタグで置換した変異体を作成し，それらをNkg7欠損CTLに導入した細胞を用いることにより，Nkg7の細胞内局在（変化）の解析や，共局在する分子や相互作用する分子の同定を行う。
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞傷害性T細胞 (CTL) は，細胞質内にパーフォリンやグランザイムと呼ばれる細胞傷害分子を含む顆粒 (傷害顆粒) をもっており，ウイルス感染細胞や腫瘍化した細胞を認識するとその中身の細胞傷害分子を標的細胞へ向けて放出して傷害することが知られている。しかしその傷害顆粒放出の制御機構については未だ不明な点が多い。本研究では，最近我々が傷害顆粒の制御に必須であることを明らかにした新規細胞傷害関連分子Nkg7について，その機能や機能発現機構の解明を目的としている。昨年度までにNkg7の一部をFlagタグで置換した変異体を作成し，またNkg7 C末に対する抗血清を得ることが出来たため，今年度はこれらを用いた解析を行い，主に以下の成果が得られた。① Nkg7に対する抗血清を用いて，CTL中のNkg7の細胞内局在について共焦点レーザー顕微鏡を用いて解析した。その際，傷害顆粒に存在するLAMP1とGranzyme Bとの共局在を検討したところ，どちらについても共局在している顆粒としていない顆粒が見られ，傷害顆粒は含まれるタンパク質の組成により複数の種類に分けられることが示唆された。② 傷害顆粒は分泌型リソソームとして知られているが，Nkg7のC末には，リソソームへの移行に必要なモチーフが存在し，Nkg7はそのモチーフに依存的に傷害顆粒膜に局在していることが予想された。しかし，C末をFlagタグに置換した変異体を作成して解析したところ，Nkg7 (の少なくとも一部は) C末に依存的に細胞表面に局在していることが示唆された。これらの結果は現在知られている知見では説明できない結果であり，今後，Nkg7のC末をヒトCD4の細胞内部分に結合させたキメラ分子を作成し，その局在を解析することにより，細胞内局在におけるNkg7 C末の役割について検討する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度はNkg7の機能部位を同定するために，Nkg7の一部をタグで置換した変異体を作成し，その遺伝子をT細胞ハイブリドーマやNkg7欠損マウスより作成したCTLに導入して変異体の細胞内局在を解析した。遺伝子導入細胞はフローサイトメトリーや共焦点レーザー顕微鏡を用いたが，フローサイトメトリーの使用には習熟しており，特に問題は無かった。共焦点レーザー顕微鏡での観察のための染色にはある程度の条件検討が必要であったが，Nkg7，LAMP1，Granzyme Bについてはスタンダードの方法で解析できた。また変異体の作成についても特に予定外のトラブルはなく，比較的計画通りに研究を進めることが出来た。
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| Strategy for Future Research Activity |
2024年度はこれまで得られた研究結果に基づき，昨年度作成した研究材料を用いて主に以下の解析を行う予定である。
① ヒトCD4とNkg7 C末のキメラ分子の遺伝子をNkg7が発現していないT細胞ハイブリドーマやNkg7欠損CTLに導入し，その細胞内の局在 (細胞表面に発現するかリソソーム/傷害顆粒に局在するか) を解析することにより，Nkg7の細胞内局在におけるC末部の機能について検討する。
② Nkg7分子の機能に重要な部位を同定するために，Nkg7の一部をFlagタグに置換した変異体をNkg7欠損CTLに導入し，CTLの細胞機能が回復するかどうかを検討する。細胞機能については傷害顆粒の放出反応と細胞傷害活性で検討する。
③ Nkg7に対する抗体，もしくはFlagに対する抗体を用いて，Nkg7と共沈するタンパク質を同定する。
④ 昨年度，Nkg7はCD4陽性T細胞のうちTh1とTregに発現することが示された。Th1についてはその主要な機能であるIFN-γ産生にNkg7が関わっていること，その際，細胞内の合成ではなく細胞外へ分泌に関与していることが示唆された。今年度はTh1細胞内でのNkg7の局在 (LAMP1やIFN-γとの共局在) についても解析する予定である。TregについてはNkg7陽性細胞と陰性細胞の２つに分かれることが明らかとなり，Nkg7陽性サブセットについては今後Tregの抑制機能にNkg7が寄与しているかどうか検討することを計画している。
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