| Project/Area Number |
22K06065
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 42040:Laboratory animal science-related
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| Research Institution | Shinshu University |
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Principal Investigator |
森 政之 信州大学, 学術研究院医学系, 准教授 (60273190)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | RNA結合タンパク質 / RNA代謝 / NCBP3 / ミュータントマウス / 病理変化 / 遺伝子変異 / マウス / 生体機能 |
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| Outline of Research at the Start |
①胎仔から12ヶ月齢までのNcbp3変異マウスの各臓器の病理学的回生機により、病態の病理・細胞学的基盤を明らかにする
②Ncbp3変異マウスの各臓器の免疫沈降解析により、NCBP3のアミノ末端と相互作用するタンパク質を同定する
③Ncbp3変異マウスの各臓器のトランスクリプトーム解析により、RNA代謝異常、およびNCBP3の標的RNAと生理機能を明らかにする
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| Outline of Annual Research Achievements |
Nuclear cap-binding protein subunit 3（Ncbp3）遺伝子に変異をもつマウスを用いて、RNA結合タンパク質であるNCBP3の生体機能の解明を進めた。
Ncbp3マウスの病理学的解析を行い、以下の知見を得た。５匹は４週齢頃から外観状明らかな水頭症を発症し、これらは全て３ヶ月齢までに死亡した。6ヶ月齢までは特に明らかな病理学的初見は認められなかった。6から20ヶ月齢のNcbp3変異ヘテロマウスの腎臓と肝臓において血管周囲の細胞の異常増殖や好酸球の浸潤が、心臓では心筋細胞内の空胞形成や核の位置異常、皮膚では皮下脂肪の薄化が認められた。しかしながら、その重篤度には個体間、および同一個体の中でも部位によってかなりの違いがあることが判明した。また、腎臓には中程度のアミロイドの沈着が認められた。蛍光免疫染色の結果、沈着したアミロイドはアポリポタンパク質A-II（AApoAII）であることが確認され、Ncbp3遺伝子変異との関連は低いと考えられた。Ncbp3変異ホモマウスは、得られた数が少ないものの、これまでに測定できた10ヶ月齢までは野生型マウスと比較して有意に体重が低かった。２匹は水頭症を発症しており、５週齢または７週齢で死亡した。臓器の病理学的所見はヘテロマウスと類似しており、その重篤度も違いは無かった。妊娠マウスを解剖し、子宮内の胎仔のジェノタイピングを行った結果、Ncbp3変異ホモマウスもメンデル則に適合する比率で発生するものの、出生直後に死亡することが明らかとなった。死亡した仔の病理学的検査では、死因を特定できなかった。
３ヶ月齢のNcbp3変異ヘテロマウスの腎臓における遺伝子転写産物の種類とその発現レベルの変化をRNA-Seq解析によって調査した。その結果、野生型マウスと比較して特徴的な違いは無いことが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Ncbp3変異ヘテロマウスについては、20ヶ月齢までの個体について病理学的解析を行い、データを収集できた。また、変異ホモマウスに関しては、生まれてくる数が少なく、十分なサンプル数を確保できない問題はあるものの、10ヶ月齢までの個体について病理学的データを得ることができた。その原因として、Ncbp3変異マウスは妊娠率、および一腹出生仔数が低いなど繁殖性が極めて悪く、かつ仔の成育も悪く、親による食殺も頻発するために、実験に使用できる個体数が制限されたことがあった。これらの問題を回避するために、Ncbp3変異ヘテロ雌マウスをホルモン投与による過排卵処理をして未受精卵の確保を試みた。しかしながら、ホルモンへの反応が悪く得られる未受精卵の数が少なかった。このホルモンへの反応性の低下は、Ncbp3変異が原因である可能性が考えられる。生まれた仔を里親に付けることで、食殺をある程度は軽減でき、これらのマウスは順調に生育・加齢している。また、Ncbp3変異ヘテロマウスの腎臓のRNA-Seq解析により、遺伝子発現プロファイルの変化を明らかとした。
NCBP3のアミノ末端に対するウサギポリクローナル抗体の作製を試みた。しかしながら、免疫沈降でうまく働いて沈降産物を作るような良い抗体が得られなかった。そのために、NCBP3のアミノ末端と相互作用するタンパク質の同定が計画よりも遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
Ncbp3変異ヘテロマウス、及び変異ホモマウスの病理学的解析を継続し、サンプル数を確保する。未病期（1ヵ月齢）、病態発症開始期（3ヵ月齢）、重篤化時期（6から12ヵ月齢）の各臓器・組織より病理組織切片を作製して病態を調査する。出生直後に死亡するNcbp3変異ホモマウスの死因を特定するために、光学顕微鏡による解析に加えて、電子顕微鏡観察、およびmicro-CTを用いた多断面再構成による胎仔のイメージング解析を行う。また、出生直後に死亡した変異ホモマウスの全身からRNAを抽出し、RNA-Seq解析を行なって、遺伝子発現プロファイルの変化を明らかとする。
NCBP3のアミノ末端と相互作用するタンパク質を同定するために、抗原とするNCBP3のアミノ末端のペプチドを変えて、抗体の作製をやり直す。良い抗体が得られたならば、HITS-CLIP法により抗体で免疫共沈降されるRNAからRNA-Seq解析用ライブラリーを作製し、次世代シークエンサーを用いてトランスクリプトームデータを収集する。さらに、さらに免疫共沈RNAからm6A RNAメチル化修飾を認識する抗体（市販品を利用）を用いてRNA免疫沈降を行い、次世代シークエンサーによる解析（Methylated RNA immunoprecipitation-sequencing）で本Ncbp3 変異マウス、C57BL/6J-Ncbp3emノックアウトマウス、および正常対照としてのC57BL/6Jマウスの系統間の違いを検出する。
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