新規RNAキャップ修飾の機能と生合成機構の解析

• Project/Area Number: 22K06077
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 43010:Molecular biology-related
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 大平 高之 東京大学, 大学院工学系研究科(工学部), 助教 (90727520)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2024: ¥650,000 (Direct Cost: ¥500,000、Indirect Cost: ¥150,000); Fiscal Year 2023: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000); Fiscal Year 2022: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000)
• Keywords: RNA / キャップ修飾 / 出芽酵母 / 遺伝子発現 / 5' cap修飾 / 転写後修飾 / 成熟化

Outline of Research at the Start

RNAのキャップ修飾は、RNAの細胞内における安定性や局在、mRNA前駆体のスプライシング効率、RNAウィルスとの識別、タンパク質合成の開始や効率など、遺伝子発現の様々な場面において重要な役割を果たしている。本研究課題では、応募者が見出した新規の反応機構によって形成されるRNAキャップ修飾を対象とし、種々の解析を通じてその生物学的意義や形成機構を詳細に明らかにすることに挑戦する。従って本研究課題は、遺伝子発現の基盤原理の理解に貢献するのみならず、RNAのキャップ修飾を介した新規の遺伝子発現制御機構の存在を探求するものである。

Outline of Annual Research Achievements

RNAの5'末端に導入されるキャップ修飾は、RNAの細胞内における安定性や局在、タンパク質合成開始の目印、ウィルスRNAとの識別に関わるなど遺伝子発現の調節領域として重要な役割を担う。従って、RNAのキャップ修飾の機能を解明すること、その機能発現に関わる生合成や分解、さらにはこれらの調節機構を詳細に明らかにすることは遺伝子発現の調節機構を理解する上で重要である。
令和４年度は、新規RNAキャップ修飾の機能を明らかにするため、新規RNAキャップ修飾の修飾酵素遺伝子の発現を抑制できる出芽酵母株から調製したTotal RNAを用いて、いくつかのRNAについてノーザンブロット解析を行い、キャップ修飾を抑制したときのRNAの定常状態量への影響を調べた。その結果、新規RNAキャップ修飾を導入されるRNAはキャップ修飾の抑制により定常状態量が若干減少していることが確認された。一方で、新規RNAキャップ修飾を導入されないRNAでは定常状態量に変化は見られなかった。この結果は、新規RNAキャップ修飾がRNAの細胞内における安定性に寄与していることを示唆する。さらに、新規RNAキャップ修飾を持つRNAを網羅的に探索するため、新規RNAキャップ修飾を持つRNAのcDNAライブラリの調製を試みた。しかしながら、cDNAライブラリを調製する過程で、新規RNAキャップ修飾を持つRNAのみが大幅に減少していることが判明した。解析の結果、新規RNAキャップ修飾の構造が原因であることが分かり、cDNAライブラリの構築方法を検討し直すこととなった。現在、新たに考案したcDNAライブラリの調製方法について条件検討を行っている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

研究計画では、RNA-seqにより新規RNAキャップ修飾を持つRNAを網羅的に探索することを予定していたが、cDNAライブラリの調製過程で、新規RNAキャップ修飾をもつRNAのみが特異的に失われていることが分かり、cDNAライブラリの調製方法を見直す必要が生じた。しかしながら、実験的にその原因を特定することができたので、代替案により本実験は継続できると判断された。一方で、新規RNAキャップ修飾がRNAの安定性に関わることが明らかとなり、本研究課題における重要な知見が得られた。以上の状況から達成度は「やや遅れている」と判断した。

Strategy for Future Research Activity

研究計画に従い、引き続き新規RNAキャップ修飾を持つRNAの網羅的探索を行うため、新たに考案したcDNAライブラリ調製方法の条件検討を行う。条件が定まり次第、様々な生物種や細胞について新規RNAキャップ修飾の網羅的探索を行い、この修飾の普遍性や特異性を明らかにし、既知のキャップ修飾との違いを明確にするとともに、この修飾がRNAの機能や遺伝子発現に与えている影響に関する知見を得ることを目指す。これと並行して、新規RNAキャップ修飾の修飾酵素による基質RNAの認識機構や反応機構についても解析を行い、網羅的探索の結果と併せることで、このキャップ修飾の細胞内における動態や調節に関する知見を得る。