アデノウイルスタンパク質による選択的オートファジーの抑制機構の解明

• Project/Area Number: 22K06082
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 43010:Molecular biology-related
• Research Institution: Osaka Metropolitan University
• Principal Investigator: 土屋 惠 大阪公立大学, 大学院工学研究科, 客員准教授 (00390691)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
• Keywords: 選択的オートファジー / アデノウイルスタンパク / 選択的オートファジーレセプター

Outline of Research at the Start

個々の細胞は外来の異物に対し、選択的オートファジーを利用した異物排除機構を備えており、この制御こそが免疫に頼らない新たな感染症対策になると期待される。申請者は異物排除において重要な役割を持つ選択的オートファジーレセプターp62が、アデノウイルスタンパクE1B-55Kによって機能が阻害されていることに着目し、ウイルス感染時に機能すべき選択的オートファジーの阻害機構を解明する。

Outline of Annual Research Achievements

細胞外の異物の侵入において、オートファジーレセプターであるp62はその初段階の認識において重要な役割を担っている。細胞への遺伝子導入効率は細胞毎に異なるが、p62の欠損は遺伝子導入効率を飛躍的に上昇させることから、細胞にとって異物である外来の遺伝子の導入はp62の活性制御やその周辺の因子に影響されると考えられる。一方で遺伝子導入効率が非常に高いHEK293細胞ではp62が恒常的に活性化されていることから、p62が活性化されていても導入効率を高く維持する機構が存在すると予想される。HEK293細胞への遺伝子導入時における内在p62結合因子を複合体として精製を試みたところ、HEK293に発現するアデノウイルス因子E1B-55Kがp62と極めて強く結合していることを発見した。本年度はE1B-55Kを発現させた細胞にDNAを結合させたビーズを導入し、p62がビーズ周囲に集積する様子を観察した。野生型細胞では細胞に導入したビーズ周囲にp62が集積する様子が観察されるが、E1B-55Kを発現させた細胞ではp62の集積が減弱することから、E1B-55Kの結合はp62が外来DNAへの集積するのを阻害していると推測された。さらにアデノウイルス感染細胞ではE1B-55KおよびE4領域の転写産物であるE4orf6が相互作用し、アポトーシスやウイルスmRNA輸送を制御することから、p62はE1B-55Kだけでなく他のウイルスタンパクや宿主タンパク質と複合体を形成する可能性が考えられた。そこでE1B-55KおよびE4orf6を共発現させた安定発現株を作成したところ、両者の発現により相乗的に遺伝子導入効率が促進される結果となった。これらの結果はアデノウイルスの感染時にウイルス自身のタンパクがp62と複合体を形成し、ウイルスの細胞内導入や増殖促進に働くことを示唆している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

２年目には蛋白―蛋白間の相互作用を定量的に測定し、その促進や阻害に働く低分子化合物のスクリーニングを行なう予定であったが、所属機関の移動により予定していた化合物ライブラリーの使用が難しくなったことから複合体の機能解析の実験を先行させることとした。研究の進捗状況には大きな影響なく進んでいると思われる。

Strategy for Future Research Activity

本年度までの結果から、アデノウイルス感染の際にはウイルス自身のタンパクがp62と共に複合体をつくり、p62が外来遺伝子に集積するのを阻害することでアデノウイルスの感染を促進していることが明らかとなった。p62の活性化に関わる上流遺伝子がウイルスの感染効率を制御していると考えられ、その制御機構の解明を行なう。得られた成果を応用し、ワクチン製造のために広く応用可能な、高効率ウイルス産生細胞の作成を試みる。

Research Products

• [Journal Article] HKDC1, a target of TFEB, is essential to maintain both mitochondrial and lysosomal homeostasis, preventing cellular senescence (2024)
  • Author(s): 1.Cui, M., Yamano, K., Yamamoto, K., Yamamoto-Imoto, H., Minami, S., Yamamoto, T., Matsui, S., Kaminishi, T., Shima, T., Ogura, M., Tsuchiya, M., Nishino, K., Layden B., Kato, H., Ogawa, H., Oki, S., Okada, Y., Isaka, Y., Kosako, H., Matsuda, N., *Yoshimori, T., *Nakamura, S.
  • Journal Title: Proceedings of the National Academy of Sciences Volume: 121 Issue: 2
  • DOI: 10.1073/pnas.2306454120
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] TBK1 inhibitors enhance transfection efficiency by suppressing p62/SQSTM1 phosphorylation (2023)
  • Author(s): Tsuchiya M, Kong W, Hiraoka Y, Haraguchi T, Ogawa H
  • Journal Title: Genes to Cells Volume: 28(1) Issue: 1 Pages: 68-77
  • DOI: 10.1111/gtc.12987
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Transcriptional coregulator Ess2 controls survival of post-thymic CD4+ T cells through the Myc and IL-7 signaling pathways (2022)
  • Author(s): Takada Ichiro、Hidano Shinya、Takahashi Sayuri、Yanaka Kaori、Ogawa Hidesato、Tsuchiya Megumi、Yokoyama Atsushi、Sato Shingo、Ochi Hiroki、Nakagawa Tohru、Kobayashi Takashi、Nakagawa Shinichi、Makishima Makoto
  • Journal Title: Journal of Biological Chemistry Volume: 298 Issue: 9 Pages: 102342-102342
  • DOI: 10.1016/j.jbc.2022.102342
  • Peer Reviewed / Open Access