| Project/Area Number |
22K06084
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 43010:Molecular biology-related
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| Research Institution | Kobe University (2023)
Nara Institute of Science and Technology (2022) |
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Principal Investigator |
那須野 亮 神戸大学, 先端バイオ工学研究センター, 特命准教授 (90708116)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
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| Keywords | 一酸化窒素 / 翻訳後修飾 / 酵母 / 還元酵素 / ニトロレダクターゼ / ニトロ化 |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では、ニトロ化修飾タンパク質を還元するニトロ化タンパク質還元酵素（NRP）を、生化学的・遺伝学的手法を用いて同定する。同様に、プロテオーム解析等を駆使し、NPRの基質タンパク質を同定する。NPRやSの遺伝子変異株を用いた網羅的解析から、NPRによるSの還元の生理機能を明らかにするとともに、生化学的解析により、その詳細な分子機構も解明する。多種生物におけるNPRやSの機能についても解析する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度までに、NO分解酵素活性を見出した酵母ニトロレダクターゼ（NTred）が、遊離ニトロチロシン（NT）に対して還元活性を示すか、組換え酵母NTred（Hbn1, Frm2）を用いて解析した。その結果、酵母NTredは遊離NTに対する還元活性を示さなかった。また、NOストレスで処理した酵母細胞中のタンパク質ニトロ化（PTN）修飾レベルを、抗NT抗体を用いたウェスタンブロッティングによって解析したところ、NTred遺伝子破壊株のPTN修飾レベルは野生型株に比べて上昇しなかった。これらの結果から、酵母NTredが遊離NTやPTN修飾の還元を介さずに、NOの直接分解によって酵母のNO耐性に寄与することが、より強く示された。
一方、NO処理した酵母をプロテオーム解析に供したところ、NO依存的にPTN修飾を受けるタンパク質や発現量が変化するタンパク質を、複数同定した。また、チロシン残基がNO依存的にアミノチロシン（AT）残基へと変換されたタンパク質も同定した。これらの内、一部については免疫沈降およびウェスタンブロットにより、PTN修飾や発現量の変化の再現性を確認した。現在、これらのタンパク質が細胞内でニトロ化タンパク質還元酵素（NPR）活性の基質となるかを確認するため、NOストレスを除去した後のPTNレベルの推移を、Tet-offなどの発現誘導制御システムを用いて解析するための準備を行っている。
また、酵素活性測定の過程で、細胞内還元剤や補因子の共存により非酵素的にNTがATへ還元されることを見出した。このことから、細胞内においては還元剤・補因子濃度の調節により間接的にNTシグナルを制御する可能性が見出された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究代表者の所属変更により研究環境の変化が生じ、従来用いていた解析系や予定していた分析系をセットアップするのに時間を要したため、プロテオーム解析後のNPR基質タンパク質の絞り込みや新規NO耐性機構の詳細な解析がやや遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
酵母NTredによるNO分解・NO耐性機構の詳細解明を早急に行う。具体的には、NTredによるNO分解（還元）の反応生成物同定、補因子や補酵素の要求性などの酵素特性の解析、速度論的解析、酸素による酵素反応阻害の解析を行う。また、酵母細胞内のNO濃度がNTredにより変化するかも評価する。
一方、NO処理した酵母のプロテオーム解析結果に基づき、候補タンパク質のPTN修飾レベルがNOストレス除去後に変化するかどうかを指標にNPR基質タンパク質Xを同定する。その後、質量分析によりPTN化Xがアミノ化Xへと還元されているか解析する。PTN化Xに対する還元活性を指標とした分画・精製やPTN化Xを用いたプルダウンアッセイなどにより、NPR候補タンパク質を同定する。
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