Sfh4-Psd2複合体によるオルガネラ間リン脂質輸送機構の構造基盤解明

• Project/Area Number: 22K06096
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 43020:Structural biochemistry-related
• Research Institution: Yamagata University
• Principal Investigator: 渡邊 康紀 山形大学, 理学部, 准教授 (30772636)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
• Keywords: リン脂質輸送 / クライオ電子顕微鏡 / リン脂質合成 / オルガネラ / リン脂質 / 膜分解 / オルガネラ間リン脂質輸送 / 立体構造解析

Outline of Research at the Start

生体膜の成分であるリン脂質の合成は，複数のオルガネラ（細胞小器官）にまたがって行われる。出芽酵母においてリン脂質ホスファチジルエタノールアミンの合成を担う代謝酵素Psd2はエンドソームに局在している。前駆体リン脂質ホスファチジルセリンはリン脂質輸送タンパク質Sfh4により小胞体膜からエンドソーム膜のPsd2のもとへ輸送されることが予想されるが，その機構は不明である。本研究では，オルガネラ間でのSfh4とPsd2によるリン脂質輸送機構解明をめざす。本研究の遂行により，細胞内リン脂質の複雑な交通網を整備する輸送システムの全貌解明に多大な貢献ができる。

Outline of Annual Research Achievements

昨年度までに、Sfh4のホスファチジルセリン（PS）輸送活性を向上させる結合因子であるPbi1との複合体（Sfh4-Pbi1複合体）について、グルタルアルデヒドにより架橋することでクライオ電子顕微鏡法による単粒子構造解析に適したサンプルを調製することができた。このサンプルを用いて単粒子構造解析を行ったところ、4.3 Å分解能の密度マップを得ることに成功した。得られた密度マップから得られた密度マップからSfh4-Pbi1複合体のモデリングを行ったところ、Sfh4-Pbi1複合体Sfh4-Pbi1ヘテロ二量体がPbi1を介して四量体を形成していることがわかった。この会合状態はAlphafold3によるSfh4-Pbi1複合体の予測構造とは全く違うものであった。Sfh4-Pbi1ヘテロ二量体に注目してlocal refinementを行ったところ、4.1 Å分解能の密度マップが得られ、より詳細な立体構造の決定に成功した。Sfh4は単体ではホモ二量体構造を形成すると示されており、Sfh4の二量体構造とSfh4-Pbi1複合体構造を比較すると、Sfh4はPbi1との結合に伴ってリン脂質結合ポケット入り口付近のヘリックスについて構造変化が起っていた。この構造変化によってSfh4-Pbi1複合体中のSfh4が持つリン脂質結合ポケットはSfh4ホモ二量体と比較して広がっていた。このことからSfh4はPbi1との複合体の形成に伴ってリン脂質が結合しやすい構造になることでPS輸送活性が向上していることが示唆された。
また、ホスファチジルコリン合成を担うリン脂質Nメチル基転移酵素PmtAの立体構造から基質認識機構および基質特異性を明らかにし、その成果をJournal of biological chemistry誌に論文として発表した。

Research Products

• [Journal Article] Structural basis for phosphatidylcholine synthesis by bacterial phospholipid N-methyltransferases (2025)
  • Author(s): Watanabe Yasunori、Kumeta Hiroyuki、Watanabe Seiya
  • Journal Title: Journal of Biological Chemistry Volume: 301 Issue: 5 Pages: 108507-108507
  • DOI: 10.1016/j.jbc.2025.108507
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The activation mechanism of Atg15, a vacuolar phospholipase required for the disintegration of organelle membranes (2024)
  • Author(s): Watanabe Yasunori、Suzuki Kuninori
  • Journal Title: Autophagy Volume: - Issue: 8 Pages: 1-2
  • DOI: 10.1080/15548627.2024.2333165
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Atg15 is a vacuolar phospholipase that disintegrates organelle membranes (2023)
  • Author(s): Watanabe Yasunori、Iwasaki Yurina、Sasaki Kyoka、Motono Chie、Imai Kenichiro、Suzuki Kuninori
  • Journal Title: Cell Reports Volume: 42 Issue: 12 Pages: 113567-113567
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2023.113567
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Activation mechanism of the vacuolar phospholipase Atg15 (2024)
  • Author(s): Yasunori Watanabe, Yurina Iwasaki, Kyoka Sasaki, Chie Motono, Kenichiro Imai, Kuninori Suzuki
  • Organizer: Yeast Lipid Conference 2024
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] オルガネラ間リン脂質輸送タンパク質Sfh4-Pbi1複合体のCryo-EM解析 (2024)
  • Author(s): 宮﨑大地、高橋祐太郎、渡邊康紀
  • Organizer: 第97回日本生化学会大会
• [Presentation] 酵母液胞リパーゼAtg15の活性化メカニズム (2023)
  • Author(s): 渡邊康紀、岩﨑佑里菜、佐々木杏佳、鈴木邦律
  • Organizer: 日本生化学会東北支部 第89回例会・シンポジウム
• [Presentation] 植物病原菌Agrobacterium tumefaciens由来リシルホスファチジルグリセロール加水分解酵素AcvBの基質認識機構 (2023)
  • Author(s): 星実津希、渡邊康紀
  • Organizer: 日本生化学会東北支部 第89回例会・シンポジウム
• [Presentation] ホスファチジルセリン輸送タンパク質Sfh4の構造生物学的研究 (2023)
  • Author(s): 宮﨑大地、高橋祐太郎、渡邊康紀
  • Organizer: 日本生化学会東北支部 第89回例会・シンポジウム
• [Presentation] ホスファチジルコリン生合成を担うリン脂質N-メチル基転移酵素PmtAによる基質認識の構造基盤 (2023)
  • Author(s): 渡邊康紀、久米田博之
  • Organizer: 第23回日本蛋白質科学会年会
• [Presentation] リシルホスファチジルグリセロール加水分解酵素AcvBの構造機能解析 (2023)
  • Author(s): 星実津希、渡邊康紀
  • Organizer: 第23回日本蛋白質科学会年会
• [Presentation] オルガネラ間リン脂質輸送タンパク質Sfh4の構造機能解析 (2023)
  • Author(s): 宮﨑大地、高橋祐太郎、渡邊康紀
  • Organizer: 第23回日本蛋白質科学会年会