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左右非対称な構造変化を起こすABC輸送体MacBの基質輸送機構の解明

Research Project

Project/Area Number 22K06099
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (C)

Allocation TypeMulti-year Fund
Section一般
Review Section Basic Section 43020:Structural biochemistry-related
Research InstitutionTokyo Institute of Technology

Principal Investigator

岡田 有意  東京工業大学, 生命理工学院, 助教 (20507181)

Project Period (FY) 2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Keywords薬剤耐性 / タンパク質 / 構造解析 / マクロライド / 抗生物質 / ABC輸送体 / 構造生物学 / 輸送タンパク質 / X線結晶解析
Outline of Research at the Start

マクロライド系抗生物質等を排出するMacB輸送体について、立体構造解析の結果から、これまで知られていた輸送体とは大きく異なる基質輸送機構モデルを提唱した。しかし、現在までにMacBと基質の複合体の構造情報は得られておらず、その輸送機構の詳細は不明である。また先行研究により、MacBのペリプラズムドメインが向きを大きく動かし、ホモ2量体間で非対称に稼働することも明らかにした。
そこで本研究では、MacBの基質結合型の立体構造解析や変異体の活性測定等を組み合わせて、非対称に稼働するMacBによる基質輸送の詳細な分子機構を解明することを目指す。

Outline of Annual Research Achievements

本研究の対象であるマクロライド系抗生物質輸送体MacBは、病原菌等の細胞膜上に存在し、病原菌にとって有害なマクロライド系抗生物質を細胞外へ排出する機能をもっているタンパク質である。このタンパク質の働きによって、病原菌に薬が効かない薬剤耐性化が起こり、大きな社会問題となっている。そのため、このタンパク質がどのようなメカニズムで抗生物質を輸送しているのかを解明することは、排出されない薬剤の設計や阻害剤の開発にとても有用な情報を与える。そこで本研究では、マクロライド系抗生物質輸送体MacBの立体構造解析等の手法を用いて、このタンパク質がどのように薬剤を排出するのかを詳細に解明することを目指した。
現在までにMacB単独や、協働する別のタンパク質との複合体の状態の立体構造は明らかにされているが、マクロライド系抗生物質等の輸送される分子が結合した状態のMacBの構造は明らかにされていない。そこでさまざまな種類の輸送分子と調製したMacBを混合し、構造解析を行った。現在までのところ輸送分子が結合した状態のMacBの構造は得られていないが、新たに得られたMacBの複数の構造情報から、どの部分の構造が大きく変化するのかが明らかとなった。これはMacBの輸送機構の詳細を解明するうえで非常に重要な情報である。今後、さらに実験条件を検討し、輸送分子が結合した状態でのMacBの立体構造解析を目指す。
さらに、ホモログタンパク質について、上記と並行して構造・機能解析を進めた。複数作成した変異体の基質輸送活性測定を行い、基質認識に重要なアミノ酸残基を複数確認することに成功した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

マクロライド系抗生物質輸送体MacBは、ATPの加水分解エネルギーを利用して基質を輸送するABC輸送体に分類されるが、外膜チャネルタンパク質等と三者複合体を形成する等、他のABC輸送体とは大きく異なった構造的特徴をもっている。またMacBの基質は、マクロライド系抗生物質の他に、ペプチド毒素、リポ多糖等生物学的に重要であり、その輸送機構の解明は重要である。現在までに複数のMacBの立体構造情報が報告されているが、いずれも基質非結合型でありMacBの基質輸送機構の詳細は不明のままである。そこで本研究では、MacBの基質結合型の立体構造を明らかにし、基質輸送の詳細な分子機構を解明することを目的とした。
さまざまな基質と精製したMacBを混合し構造解析のための結晶化条件の探索を行った。複数の条件で結晶が得られ、それらを用いてX線回折実験を行い、それぞれ構造解析を行った。その結果、現在までに基質の結合は確認できなかった。しかし、得られた複数の基質非結合型のMacBの立体構造情報から、膜貫通ドメインとペリプラズムドメインを繋ぐループ部分が大きく構造変化を起こしていることを明らかにした。今後、さらに結晶化条件の検討を行い、基質結合型のMacBの立体構造解析を行い、基質輸送機構の詳細な解明を目指す。
またホモログタンパク質において、同様に構造・機能解析を進めた。基質結合部位に変異を導入し、基質特異性に変化が生じるかを、基質排出活性を測定することによって確かめた。その結果、基質結合部位に存在する複数のアミノ酸が、基質認識に重要であることが示唆された。

Strategy for Future Research Activity

MacB-基質複合体の構造を得るために、結晶化条件の探索を行う。基質の種類やMacB精製条件の検討を行う。また、これまでに得られている構造情報から、基質輸送に重要と考えられる残基に変異を導入する。それらを用いて最小発育阻止濃度を測定することで基質輸送活性の変化を観察し、それらの情報も組み合わせて、基質輸送機構のモデルを構築する。
さらにホモログタンパク質の構造・機能解析も同時に進め、上記と同様に基質結合部位の構造と基質特異性の関係性を明らかにする。

Report

(2 results)
  • 2023 Research-status Report
  • 2022 Research-status Report
  • Research Products

    (6 results)

All 2024 2023 2022

All Journal Article (3 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Peer Reviewed: 3 results,  Open Access: 3 results) Presentation (2 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results) Book (1 results)

  • [Journal Article] Dissection of an ABC transporter LolCDE function analyzed by photo-crosslinking2024

    • Author(s)
      Tao Kazuyuki、Narita Shin-ichiro、Okada Ui、Murakami Satoshi、Tokuda Hajime
    • Journal Title

      The Journal of Biochemistry

      Volume: 175 Issue: 4 Pages: 427-437

    • DOI

      10.1093/jb/mvad118

    • Related Report
      2023 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Crystal structures of multidrug efflux transporters from Burkholderia pseudomallei suggest details of transport mechanism2023

    • Author(s)
      Kato Takaaki、Okada Ui、Hung Li-Wei、Yamashita Eiki、Kim Heung-Bok、Kim Chang-Yub、Terwilliger Thomas C.、Schweizer Herbert P.、Murakami Satoshi
    • Journal Title

      Proceedings of the National Academy of Sciences

      Volume: 120 Issue: 29 Pages: 1-12

    • DOI

      10.1073/pnas.2215072120

    • Related Report
      2023 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Structural and functional characteristics of the tripartite ABC transporter2022

    • Author(s)
      Okada Ui、Murakami Satoshi
    • Journal Title

      Microbiology

      Volume: 168 Issue: 11 Pages: 1-15

    • DOI

      10.1099/mic.0.001257

    • Related Report
      2022 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] Structural and functional analysis of multidrug RND transporters from Burkholderia pseudomallei2023

    • Author(s)
      Ui Okada, Takaaki Kato, Li-Wei Hung, Eiki Yamashita, Heung-Bok Kim, Chang Yub Kim, Thomas C. Terwilliger, Herbert P. Schweizer, Satoshi Murakami
    • Organizer
      Multi-Drug Efflux Systems Gordon Research Conference
    • Related Report
      2023 Research-status Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Structural and functional analysis of multidrug RND transporters from Burkholderia pseudomallei2022

    • Author(s)
      Ui Okada, Takaaki Kato, Li-Wei Hung, Eiki Yamashita, Heung-Bok Kim, Chang Yub Kim, Thomas C. Terwilliger, Herbert P. Schweizer, Satoshi Murakami
    • Organizer
      Multi-Drug Efflux Systems Gordon Research Conference
    • Related Report
      2022 Research-status Report
    • Int'l Joint Research
  • [Book] Therapeutic Protein Targets for Drug Discovery and Clinical Evaluation: Bio-Crystallography and Drug Design2022

    • Author(s)
      D Velmurugan, Atanu Bhattacharjee, and D Gayathri 編, Ui Okada and Satoshi Murakami 著 (chapter 1)
    • Total Pages
      404
    • Publisher
      World Scientific
    • ISBN
      9789811254796
    • Related Report
      2022 Research-status Report

URL: 

Published: 2022-04-19   Modified: 2024-12-25  

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