| Project/Area Number |
22K06103
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 43020:Structural biochemistry-related
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
溝端 栄一 大阪大学, 大学院工学研究科, 講師 (90571183)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
Fiscal Year 2022: ¥520,000 (Direct Cost: ¥400,000、Indirect Cost: ¥120,000)
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| Keywords | 構造生物化学 / X線自由電子レーザー / 膜タンパク質 / アニオンチャネル |
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| Outline of Research at the Start |
重原子イオンをチャネル膜タンパク質の結晶と混合してXFELの異常散乱を用いてイオン透過機構の動的構造解明を目指す。
最初に、陰イオンはチャネル表面や細孔内のどの部位にどの程度局在するのか検証する。そのために、XFEL結晶解析でチャネルと陰イオン（ヨウ素イオンなど）の相互作用を原子分解能で常温観察する。また、S型チャネルの機能は不明な点が多いため、陽イオンの関与があるのか否かもあわせて検証する。
陰イオンの結合を可視化出来たら、次に、ゲートPheをどのような構造変化をともない陰イオンが通過するのかの構造基盤を明らかにする。そのために、野生型およびイオン透過能が優れたゲート変異型の構造を決定する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
微生物から植物に至るまで存在する膜貫通型タンパク質であるS型アニオンチャネルは、細胞膜を通じてさまざまな陰イオンを透過する。そのイオン透過機構は、従来のアニオンチャネルとは異なる可能性が指摘されているが、いまだ解明されていない。この研究の目的は、S型アニオンチャネルとその透過する陰イオンとの相互作用を可視化することである。
昨年度に引き続き、インフルエンザ菌由来のS型アニオンチャネル膜タンパク質について、XFEL施設SACLAにて微小結晶の回折データを高分解能で収集するための結晶性の改良を進めた。特に、新たにLipidic cubic phase法での結晶化条件の探索を行った。
一方、インフルエンザ菌由来のS型アニオンチャネルとはアミノ酸配列が大きく異なる、真核生物由来のオーソログタンパク質について、コンストラクトを種々工夫することで発現量を改善して精製する条件を確立した。１回の精製収量が1－2mg程度と少ないことから、Lipidic cubic phaseでの結晶化条件の探索と並行して、結晶を用いずに構造解析可能なクライオ電子顕微鏡を用いた構造解析の可能性を検討した。精製バッファー中の塩濃度、界面活性剤の種類と濃度、カラムクロマトグラフィーの条件検討を進めることで、クライオ電子顕微鏡のグリッド上に良好に分散した単粒子のイメージを撮影できる条件を見出した。予備的なイメージデータの撮影とデータ解析の結果、分解能約8オングストロームで構造を決定することに成功し、１０本のヘリックスから成るモノマーが３つ会合したトリマー構造を明らかにできた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
インフルエンザ菌由来のS型アニオンチャネル膜タンパク質について、高分解能の回折像を得るための結晶性の改良の進捗はやや遅れているものの、替わりに真核生物由来の膜タンパク質の発現・精製条件を確立したことは、S型アニオンチャネルの構造機能相関の解明に向けた一定の進捗が得られた。
また、この真核型チャネルの三次元構造を低分解能ながらクライオ電子顕微鏡によって初めて決定できたことは、今後の高分解能での解析につながる重要な成果である。
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| Strategy for Future Research Activity |
インフルエンザ菌および真核生物由来のS型アニオンチャネル膜タンパク質について、SACLAで高分解能の回折能を与える結晶を調製する条件を引き続きスクリーニングする。
一方、クライオ電子顕微鏡を用いて低分解能での構造が得られた真核生物由来の膜タンパク質について、今後、より高分解能での構造解析を行うための測定条件の検討を行う。膜タンパク質に種々のアニオン（塩化物イオン、硝酸イオン、硫酸イオンなど）を添加した条件で精製や測定を行うことで、これらのアニオンと膜タンパク質の複合体構造の取得を目指す。
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