| Project/Area Number |
22K06105
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 43020:Structural biochemistry-related
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| Research Institution | Musashino University |
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Principal Investigator |
桑迫 香奈子 武蔵野大学, 薬学部, 講師 (10568736)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
坂本 泰一 千葉工業大学, 先進工学部, 教授 (40383369)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
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| Keywords | mRNAスプライシング / U2 snRNP / RNAアプタマー / pre-mRNAスプライシング |
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| Outline of Research at the Start |
U2 snRNPは，mRNA前駆体のスプライシングにおいて，イントロン上のブランチ部位を認識して結合し，スプライシング反応の活性中心を形成する。ヒトでは，ブランチ部位とされる配列は複数あるが，これら複数のRNA配列をどのようにしてU2 snRNPが認識しているのかは未知である。本研究では，このU2 snRNPによる認識を「ゆるい」と定義して，この特徴的なRNA認識機構をRNAアプタマーを利用して解明する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
U2 snRNPは，mRNA前駆体のスプライシングにおいて，イントロン上のブランチ部位を認識して結合し，スプライシング反応の活性中心を形成する。ヒトでは，ブランチ部位とされる配列は複数あるが，これら複数のRNA配列をどのようにしてU2 snRNPが認識しているのかは未知である。本研究では，このU2 snRNPによる認識を「ゆるい」と定義して，この特徴的なRNA認識機構をRNAアプタマーを利用して解明する。
本研究で利用するアプタマーがスプライシングに与える影響を確認するため，インビトロでのスプライシングアッセイ系の作製を試みた。基質となるmRNA前駆体は，T7 RNAポリメラーゼによる転写反応によって合成するため，鋳型のDNAをプラスミドの形で精製し，制限酵素処理によりRun-offさせられる形とした。これを用いて転写反応を行い，その産物を変性PAGEで確認したところ，単一バンドとして検出できた。そこで，鋳型のDNAをDNaseで分解した後，フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によって基質mRNA前駆体を精製した。これを蛍光標識し，購入した核抽出物等と混合してインビトロスプライシング反応を行った後，Proteinase K処理とエタノール沈殿によって得た核酸を変性PAGEしたが，スプライシングされたRNA断片を検出することはできなかった。その理由として，RNAの検出感度の問題があると考えた。つまり，一般的にインビトロスプライシング反応に用いる基質mRNA前駆体は，検出感度が高いRI標識法が用いられるが，本学にはRI設備がないため，蛍光標識法を採用した経緯がある。そこで，検出方法をRT-PCR法へと変更したところ，予備実験の段階ではあるが，基質mRNA前駆体と，スプライシングされたmRNAを検出することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
個人的な理由ではあるが，申請者のひざの手術およびリハビリ等により，通常の生活が送れるようになるまで時間がかかってしまったため，実験する時間がかなり制限された。
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| Strategy for Future Research Activity |
インビトロでのスプライシングアッセイ系の検出法に関しては，RT-PCR法を採用する予定である。今後は，予備実験の再現性を確認するとともに，検出しているものがスプライシングによる結果の産物であることを示すため，スプライシング反応の阻害剤の添加量に依存して反応産物量が変化するかを確認する。系の確立後，RNAアプタマーを添加し，スプライシング反応にどのような影響を及ぼすのか調べる。
また，この系は，アプタマーの短鎖化や改変だけでなく，U2 snRNPに結合するスプライシング制御因子の添加による影響の検出にも利用できる。そこで，U2 snRNPに結合するスプライシング制御因子の調製にも，再度，無細胞タンパク質合成系を利用するなどして取り組む予定である。
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