| Project/Area Number |
22K06121
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 43030:Functional biochemistry-related
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
二井 勇人 東北大学, 農学研究科, 准教授 (90447459)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
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| Keywords | 膜内切断プロテアーゼ / 認知症 / 酵母 / 酵素 / アルツハイマー病 / 脳神経疾患 / 神経科学 / バイオテクノロジー / 応用微生物 |
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| Outline of Research at the Start |
膜内切断プロテアーゼは、水が存在しない膜内で加水分解を行う特殊なタンパク分解酵素で、どのようにして反応を遂行するのかについて、よく分かっていない。代表的な膜内切断プロテアーゼであるγセクレターゼ複合体は、アルツハイマー病の原因となる脳内アミロイドを作り出す、認知症治療において重要なターゲット分子である。本研究では、モデル生物である出芽酵母を使った独創的な解析手法と、クライオ電子顕微鏡を用いたタンパク質立体構造解析手法を統合的に用いることで、γセクレターゼ複合体による分解のメカニズムを明らかにする。認知症治療薬の開発への戦略を提案する成果が期待される。
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| Outline of Annual Research Achievements |
膜内切断プロテアーゼは疎水的な膜環境で特殊な加水分解を行うため、酵素学的には未知の点が多い。本研究では、認知症の原因となるアミロイドβペプチドを生成するγセクレターゼの活性化の分子機構を解明するために、Ⅰ. 酵母モデル系を活用したγセクレターゼ活性調節・基質認識機構の解明と、Ⅱ. γセクレターゼ活性化変異体のコンホメーション変化の解明を目的とした。
令和５年度においては、Ⅰ.酵母モデル系を活用した研究では、１）アミロイド前駆体(APP)切断部位のカルボキシ末端側の基質結合部位に注目し、APP（基質）とプレセニリン（酵素,γセクレターゼの触媒サブユニット）の両方に同定した切断活性化変異の相互作用を解析した。切断の活性化には基質―酵素間のイオン相互作用が重要であることが明らかとなった。２）γセクレターゼの新たな基質として膜貫通型レクチンVIP36を同定した。一方、VIP36のホモログVIPLの膜貫通領域はほぼ切断を受けず、切断部位近傍の配列が切断効率を決める要因となることを明らかにした。
Ⅱ. γセクレターゼ活性化変異体の構造解析では、１）ヒト胎児腎臓293F細胞を用いたγセクレターゼ大量発現系を構築した。CAGプロモーターでγセクレターゼの４サブユニットを発現するpMLinkプラスミドを構築し、293F細胞に遺伝子導入（リポフェクション）して一過性発現させた。
２）Flagタグ（Pen2-Flag）抗体によるアフィニティ精製とゲルろ過クロマトグラフィーにより均一な複合体に精製した後、クライオ電子顕微鏡解析により粒子状態を確認し、３次元再構成を行った。粒子数が少なく、立体構造の解明にはいたらず、改善の余地が残った。酵母大量発現系では、γセクレターゼ活性化変異体のサブユニット構成が保たれず、ニカストリンの含量が低い問題があったが、293F細胞で発現することにより解決した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
実施を予定していた（I）酵母モデル系を活用したγセクレターゼ活性調節・基質認識機構の解明と、（II）γセクレターゼ活性化変異体のコンホメーション変化の解明について、達成度を自己評価する。
(I）酵母モデル系を用いたスクリーニングで、基質結合部位に存在するアミロイド前駆体の変異部位とプレセニリンの変異部位について19種のアミノ酸に変化させ切断を活性化する要因を明らかにした。また、決断効率が著しく異なるホモログタンパク質（VIP36とVIPL）間で配列を入れ替えて、切断部位近傍の配列が切断効率を決める要因となることを明らかとした。いずれも遺伝学的な手法が簡便な酵母の系の利点を活かしてγセクレターゼの触媒機構を明らかにしたことは意義深い。アルツハイマー病の治療薬の開発にもつながる成果である。
(II)また、前年度問題があった酵母γセクレターゼ大量発現系から、293F細胞を使ったγセクレターゼ大量発現系に変更し、発現系と精製系を構築した。さらにはクライオ電子顕微鏡の解析によってγセクレターゼの粒子を確認する目標を達成し、ニカストリンの含量が少ないという酵母の系の課題を解決した。今後は、活性化変異体の立体構造の解明に向けて、293F細胞の大量発現系を改良し、精製条件を最適化する必要がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の予定通り、γセクレターゼの機能と構造を解析する研究を進める。
１年目にAPPの切断部位における切断感受性変異体の解析に成功して、APP変異体を解析する展望が開けた。γセクレターゼの構造解析においては、酵母の系でのγセクレターゼ大量発現には成功したが、精製過程でニカストリンが外れる問題点が見つかった。
２年目は、変異体の詳細な解析からγセクレターゼとAPPの相互作用による基質認識機構を解明した。γセクレターゼの構造解析においては、ヒト293F細胞を用いたγセクレターゼ発現により、クライオ電子顕微鏡での解析へと進んだ。
最終年度は、酵母での切断活性化変異のスクリーニングを続行し、認知症治療薬のターゲットとなりうる基質―酵素結合領域を探索し、哺乳類細胞を用いた機能解析を行う。またクライオ電子顕微鏡を用いた解析から、γセクレターゼ活性化変異体の立体構造を解明し、人工知能を用いた動的コンホメーション解析を行う。
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