| Project/Area Number |
22K06133
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 43030:Functional biochemistry-related
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| Research Institution | Tokyo University of Science |
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Principal Investigator |
十島 二朗 東京理科大学, 先進工学部生命システム工学科, 教授 (00333831)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | GPCR / エンドサイトーシス / リサイクリング / ゴルジ体 / エンドソーム |
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| Outline of Research at the Start |
Gタンパク質共役受容体（GPCR）はリガンドの結合により活性化されると、エンドサイトーシスにより細胞内へと取り込まれる。その後、取り込まれた受容体は不活性化され、リソソームで分解、もしくはリサイクル経路により細胞膜へ運ばれ再利用されるが、その基本的な分子機構には不明な点が多い。私達は以前の研究において出芽酵母変異体ライブラリーの網羅的スクリーニングを行い、GPCRのエンドサイトーシス機構に異常のある変異体を多数単離した。本研究は、これらの出芽酵母変異体について、責任遺伝子がコードするタンパク質の機能解析により、GPCRのエンドサイトーシスによる分解・再利用の諸過程を制御する分子機構を解明する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞膜上の受容体はリガンドの結合により活性化されると、エンドサイトーシスにより細胞内へと取り込まれる。その後、取り込まれた受容体は不活性化され、リソソームで分解、もしくはリサイクル経路により細胞膜へ運ばれ再利用される。Gタンパク質共役受容体（GPCR）も、同様にエンドサイトーシスにより不活性化されるが、その基本的な分子機構には不明な点が多い。本研究は、以前に単離することに成功したGPCRのエンドサイトーシス機構に異常のある出芽酵母変異体について、責任遺伝子がコードするタンパク質の機能解析により、GPCRのエンドサイトーシスの諸過程を制御する分子機構を解明することを目的とする。特に、GPCRの分解・リサイクルの基本的な分子機構を解明し、それを新しいGPCR作用薬開発の基盤とすることを目的とする。これらの目的について、昨年度は、①GPCRがクラスリン小胞に取り込まれる分子機構、②GPCRのクラスリン小胞から初期エンドソームへの輸送機構、③GPCRの初期エンドソームでのリサイクリング機構、④GPCRの初期－後期エンドソームへ輸送におけるRabタンパクの機能解析、の４つの課題について研究を実施した。この中で、①については細胞膜の主要構成成分の一つであるホスファチジルイノシトールリン酸(PI(4)P, PI(4,5)P2)がエンドサイトーシスされたGPCRの細胞膜へのリサイクリングに重要な役割を果たしていることを明らかにした。②③については、GPCRが初期エンドソームから分解経路に輸送される過程におけるアクチン骨格、融合タンパク質の役割を明らかにした。さらに、④についてはGPCRがエンドサイトーシスされる際に、ポストゴルジ体輸送経路を介して低分子量Gタンパク質Rab5を活性化される分子機構ことを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
研究計画にあげた４つの課題について、①については、ホスファチジルイノシトールリン酸(PI(4)P, PI(4,5)P2)を特異的に標識する蛍光マーカーを用いて、野生型細胞および変異体について調べた。この結果、GPCRの輸送に異常が見られる幾つかの変異体でPI(4)Pの局在、もしくは産生量が変化していることを見出した。また、PI4キナーゼ変異体では初期エンドソームの成熟過程に異常があることを明らかにした。この研究成果については、昨年欧文雑誌JCS誌に発表している。②については、細胞内に取り込まれたクラスリン小胞のアクチン骨格を介した輸送機構について解析を進めた。ペルオキシソームにアクチン重合促進因子を異所的に発現させることにより、本来形成されない場所でのアクチンフィラメントの形成を誘導した結果、興味深いことにペルオキシソーム部位でのエンドサイトーシス小胞の集積を引き起こすことができることを明らかにした。③については、GPCRのリサイクリング経路を特異的に標識することができる蛍光マーカーの作製に成功した。この新規蛍光マーカーを用いて、ゴルジ体内の特定領域がリサイクリング経路の制御において重要なはたらきをしていることを明らかにした。さらに、④については、GPCRが初期エンドソームから分解経路へと輸送される過程における、Rab5の活性化機構を明らかにした。特に、ゴルジ体からエンドソームへの輸送小胞のアダプター分子が重要な役割を果たしており、アダプタータンパク質のEnt3, Ent5やAP1複合体が小胞へのRab5の活性化因子(GEF)であるVps9pのリクルートが重要であることを明らかにした。この成果についてはJCS誌に発表している。
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| Strategy for Future Research Activity |
①GPCRがクラスリン小胞に取り込まれる分子機構については細胞膜およびゴルジ体膜におけるPI(4)Pの機能をさらに詳しく解析する。具体的には、細胞膜のPI(4)P産生を抑制した際の、GPCRのクラスリン小胞への取り込みへの影響を解析する。②GPCRのクラスリン小胞から初期エンドソームへの輸送機構については高速超解像蛍光顕微鏡を用いて、クラスリン小胞がエンドソームに輸送される過程について詳細に解析する。また、アクチン骨格形成に異常のある変異体について、小胞過程への影響を調べる。さらに、小胞融合に関わる係留タンパク質、SNAREタンパク質の変異体についても同様に調べ、クラスリン小胞-エンドソーム間の輸送・融合に必要な因子を同定する。③GPCRの初期エンドソームでのリサイクリング機構については、エンドソームの酸性化がRab6、GARP複合体、レトロマー複合体などの機能にどのような影響を与えるかについて解析する。④GPCRの初期－後期エンドソームへ輸送におけるRabタンパクの機能解析については、Rab5との物理的、遺伝学的相互作用について解析し、GPCRが初期エンドソームから分解・再利用経路へと輸送される機構を明らかにする。
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