シナプスと行動の可塑的変化におけるグリピカンの糖鎖修飾の役割

Research Project

Project/Area Number	22K06138
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 43030:Functional biochemistry-related
Research Institution	Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
Principal Investigator	神村圭亮公益財団法人東京都医学総合研究所, 脳・神経科学研究分野, 主席研究員 (30529524)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2024: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000) Fiscal Year 2023: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000) Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Keywords	ヘパラン硫酸 / プロテオグリカン / グリピカン / シナプス / シナプス可塑性 / へパラン硫酸
Outline of Research at the Start	これまで我々は、グリピカンがグルタミン酸受容体の局在を調節することで、飢餓時に誘導されるシナプスの形態変化と探餌行動を調節することを見出した。しかしながら、このような可塑的変化において HS 鎖とその微細構造がどのような役割を果たすのかは全くわかっていない。そこで本研究では、モデル生物であるショウジョウバエを用い、シナプスと行動の可塑的変化におけるグリピカンの HS 鎖とその微細構造の役割を明らかにすることを目的とする。
Outline of Annual Research Achievements	ニューレキシンやグリピカンなどの細胞膜表面に局在するヘパラン硫酸プロテオグリカン (HSPG) は様々な分子と相互作用することでシナプス形成に深く関与する。またこれらの HSPG の異常が自閉症や統合失調症などの神経・精神疾患を引き起こすことが知られている。一方、シナプスにおいて HSPG が機能する上で複雑な構造を持つヘパラン硫酸 (HS) 鎖がどのような役割を果たすのかは良く分かっていない。一方、これまでの我々のショウジョウバエを用いた解析から、HSPG の一つであるグリピカン Dally-like (Dlp) が飢餓時に誘導されるシナプスの可塑的な形態変化と探餌行動に必要であることが判明している。そこで次にこのシナプスと行動の可塑的変化における Dlp の HS 鎖とその微細構造の役割に着目し解析を進めた。まず Dlp の HS 鎖の機能を明らかにするため、CRISPR-Cas9 を用いたゲノム編集により Dlp の全ての HS 付加部位 (セリン残基) をアラニンに置換した dlpΔHS 個体を作製した。シナプス及び行動の可塑的変化における Dlp の HS 鎖の役割を調べるため、 dlpΔHS 個体における飢餓依存的なシナプス終末の形成及び幼虫の探餌行動を調べた。その結果、dlpΔHS 個体においては dlp 欠失個体と同様に飢餓状態においてもシナプス終末の数及び幼虫の移動速度が増加しないことが判明した。この結果から Dlp がシナプス及び行動の可塑的変化において HS 鎖を介して機能することが示された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason アグリン、ニューレキシン、グリピカン及びシンデカンなどの HSPG はシナプス形成において中心的な役割を果たす一方、それぞれの HS 鎖が果たす役割については不明である。我々の研究においてもショウジョウバエのシナプスにおけるグリピカン Dlp の重要性を見出したが、その HS 鎖の役割については未解明であった。この問題を明らかにするために、 Dlp の HS 鎖だけを欠失した dlpΔHS 個体を作製し解析を行ったところ、dlpΔHS 個体は dlp 欠失個体と同様にシナプスと行動の可塑性に異常をきたすことが判明した。この結果は、シナプスにおいて Dlp は HS 鎖を介して機能することを示すものである。本研究のようなシナプスにおける特定の HSPG の HS 鎖の役割に着目した研究は少なく、今後解析を進めることで HS 鎖の詳細な作用機序が明らかになると考えられる。
Strategy for Future Research Activity	HS は微細な糖鎖構造を介して様々な分子と相互作用することが報告されている。そこで次に Dlp がどのような HS 微細構造を介して機能するのかを調べる。これまでに作製した様々な HS 修飾酵素の欠失変異体及び過剰発現個体を用いて、HS 微細構造の変化が飢餓によるシナプス終末の形成、グルタミン酸受容体の増加、及び幼虫の移動速度の変化にどのような影響を与えるのかを解析する。異常が観察された HS 修飾酵素に関しては、組織特異的 (運動神経細胞、筋細胞、及びグリア細胞) RNAi 法を用い、それらの個体が示す異常と欠失変異体の表現型を比較することで修飾酵素が機能する細胞を特定する。次に各 HS 修飾酵素の標的となる HSPG が Dlp であるかどうかを調べるために、修飾酵素と HSPG コアタンパク質 (Dlp, シンデカン、ニューレキシン) の二重欠失変異体を作製し単独欠失変異の表現型と比較する。修飾酵素が Dlp の HS 鎖を標的とする場合、dlp - HS 修飾酵素二重欠失変異体は dlp 欠失変異体と類似した表現型を示すことが予測される。さらに、飢餓時において HS の微細構造が変化する可能性についても検討する。HS の微細構造を認識する様々なファージディスプレイ抗体を用いた免疫組織化学染色法により、飢餓時においてどのように HS の微細構造が変化するのかを調べる。以上の解析により、シナプス及び行動の可塑的変化における HS 微細構造の役割を明らかにする。