脱リン酸化を介した神経細胞カルシウムシグナル全貌解明のための基盤研究

• Project/Area Number: 22K06139
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 43030:Functional biochemistry-related
• Research Institution: Tokyo Women's Medical University (2023); The University of Tokyo (2022)
• Principal Investigator: 千村 崇彦 東京女子医科大学, 医学部, 助教 (90392034)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2024: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000); Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2022: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
• Keywords: シグナル伝達 / 神経細胞 / 神経可塑性 / カルシウム

Outline of Research at the Start

「カルシウムイオンがどのように神経可塑性を制御するのか？」
この根源的な問いに答えるため、神経細胞に発現する蛋白質に着目し、その分子的特性を調節するリン酸化状態、特にカルシウム依存的に起こる脱リン酸化反応の制御機構を解明する。新規に発見した脱リン酸化反応とその検出法を用い、（１）この系を制御しうる因子として我々が独自に単離した新規蛋白質が脱リン酸化制御に果たす役割を明らかにすると共に、（２）脱リン酸化反応の標的となる新規な基質蛋白質の探索を進める。

Outline of Annual Research Achievements

「カルシウムイオンがどのように神経可塑性を制御するのか?」
この根源的な問いに答えるため、神経細胞に発現する新規蛋白質に着目すると共に、カルシウム依存的に起こる脱リン酸化反応の制御機構の解明を進めている。研究計画に従い2023年度も以下の２点を主たる研究の柱として解析を進めた。
(1)神経細胞に発現している新規蛋白質UF1が前述の脱リン酸化制御に果たす役割を解明すること、(2)当該脱リン酸化反応の標的となる新規な基質を、プロテオミクス解析を用いて網羅的に探索すること。
2023年度の進捗状況を以下に述べる。
(1)UF１の生化学特性の詳細な解析を進めた。前年度に同定した新規な生化学的活性即ち「カルシウム依存的な脱リン酸化反応を抑制する活性」を担う部位の特定を進め、UF1分子内において当該活性を担う責任領域を同定した。興味深いことにその活性のON-OFFを調節する「分子スイッチ」として機能する領域も同定した。当該領域に存在するSer/Thr残基はリン酸化されることが公共データベースで示されており、リン酸化が分子スイッチとして機能する可能性を検討したところ、実際にリン酸化が分子スイッチとして機能しうることが示唆された。当該サイトをリン酸化するキナーゼの同定により神経可塑性制御の分子機構に関して新たな展開が期待される結果を得た。
(2)2022年度に行った予備実験をさらに進め、質量分析に供するサンプル調製方法を確立した。当該条件による質量分析で、複数の蛋白質においてリン酸化制御の対象となるアミノ酸サイトの同定に成功し、約300種の蛋白質が脱リン酸化反応の新規な標的候補であることが判明した。これまでに想定されていないシグナル伝達系分子が含まれるとともに、機能未知分子も複数含まれるため、細胞内におけるカルシウムシグナル伝達系の理解と新たな洞察に繋がることが期待される。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

自身の所属変更等により研究環境・実験条件の再構築の必要性が生じ、特に神経細胞初代培養系を用いる細胞生物学的な実験に関して時間を要した。そのため、前年度に生じた研究棟改修工事に伴う研究の遅れを回復させるには至らなかった。

Strategy for Future Research Activity

（１）UF1が有する「脱リン酸化反応抑制活性」を制御する分子スイッチ領域の特定という重要な発見があり、しかもそれがリン酸化による制御である可能性が示唆された。おそらくこの領域に対するリン酸化の有無がUF1の分子内もしくは別の分子との結合を調節していることが予想される。このスイッチは細胞内カルシウム伝達系が神経可塑性を制御する際に極めて重要な機構である可能性が高いため、そのメカニズムの解明を生化学的に進める。
（２）質量分析によりリン酸化・脱リン酸化を受ける候補として同定された300余の蛋白質に関し、ジーンオントロジー解析により全体像を把握すると共に、個々の蛋白質の機能や関与する細胞内プロセスごとに解析蛋白質を選定する。それらに関し、実際に脱リン酸化の標的となっているかを特異的抗体もしくは細胞内強制発現系等用いて確認するとともに、UF1の制御の対象となっているかについても検討する。