| Project/Area Number |
22K06150
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 43030:Functional biochemistry-related
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| Research Institution | Iwate University (2023)
Jikei University School of Medicine (2022) |
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Principal Investigator |
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
李 勇燦 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 助教 (00894932)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | cystinuria / amino acids / transporter / kidney / structure / HATs / homeostasis / exchanger / amino acid / mass spectrometry |
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| Outline of Research at the Start |
ヘテロ二量体アミノ酸トランスポーター（HATs）は、高等真核生物に特異的に発現しているアミノ酸輸送ファミリーである。HATsの機能は、細胞レベルの栄養調和から組織レベルのアミノ酸再吸収・吸収に至るまで、多階層にわたり重要である。HATの機能不全は、がんの増殖、酸化還元バランスの崩れ、腎臓の遺伝性疾患であるシスチン尿症などの原因となる。そのため、HATの輸送機構を理解することは、それらの疾患に対する治療へのアプローチとして重要である。本研究では、HATの輸送機構を詳細に明らかにすることを目的とする。この研究によるHAT輸送機能の理解が基盤となり、HAT研究が創薬・治療につながることが期待される。
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヘテロ二量体アミノ酸トランスポーター (Heterodimeric amino acid transporters: HATs) は、哺乳類の数多くの細胞活動において重要な役割を果たすアミノ酸トランスポーターのファミリーである。HATsのトランスポーターメンバーは抗輸送体として機能し、数種類のアミノ酸を認識するため、HATはハーモニーのための主要なアミノ酸トランスポーターファミリーとなっている。HATの交換特性を理解するために、代表者らはrBAT-b0,+ATヘテロ二量体複合体の構造と機能を解明した。rBAT-b0,+ATは腎臓でシスチンと陽イオン性アミノ酸を再吸収する機能を持つ。rBATまたはb0,+ATのいずれかに変異があると、シスチン尿症と呼ばれる腎臓病になる。代表者らはrBAT-b0,+ATの野生型と変異型の両方の構造を低温電子顕微鏡によって高分解能で解明することに成功し、原子レベルでの構造解析が可能になった。代表者らは、rBAT-b0,+ATの野生型と変異型の両方の構造を低温電子顕微鏡法によって高分解能で解明することに成功し、原子レベルでの構造解析が可能になった。野生型複合体の構造は、基質結合のない内向きのコンフォメーションを示した。一方、変異体の構造は、野生型とは異なる位置にあるいくつかの残基を示した。これらの残基は基質輸送に重要であり、シスチン尿症におけるrBAT-b0,+AT欠損の発症メカニズムに関与していることが示唆された。このような残基の重要性を検証するため、我々はさらに変異体を構築し、その基質結合および輸送特性を評価した。これらのすべての結果は、HATのタンパ ク質構造と交換輸送機構の関係を説明する鍵になるものである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
The research team aims to achieve high-resolution structures to evaluate important residues for the exchange properties of HATs. By optimization of lipid composition and reconstitution conditions, we succeeded in obtaining the stable protein complex in lipid nanodiscs, allowing structural analysis to go smoothly. Finally, high resolutions of both wild-type and mutant structures were obtained.
Structural analysis between the wild-type and mutants led to predict key residues for protein conformation alteration. Based on the results, we also expanded mutation analysis and predicted some additional residues for the transport mechanism. Expression and localization verified that the mutants do not alter plasma membrane translocation, convincing their specificity in the transport mechanism.
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| Strategy for Future Research Activity |
The results from wild-type and mutant structures predicted important residues for protein conformation and transport function. The research team plans to focus on the functional analysis of these mutant residues by using cell-free assays. For substrate binding, interactions of the purified transporters and each amino acid will be determined in lipid nanodisc. For transport dynamics, proteoliposome will be employed to determine transport directions and kinetics. The results of all mutants will be compared with the wild-type and the roles of predicted residues will be obtained. Finally, this finding feature will be compared with other HAT members such as rBAT-AGT1. All results will be summarized and the model of exchange transport mechanism in HATs will be proposed.
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