| Project/Area Number |
22K06158
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 43040:Biophysics-related
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
茅 元司 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 助教 (00422098)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
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| Keywords | 細胞融合 / 膜張力 / 細胞質流動性 / 筋細胞融合 / 機械学習 / 筋細胞 |
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| Outline of Research at the Start |
機械学習による細胞のセグメンテーションによるトラッキング，多変量解析を用いて細胞の分類分けとその特徴量を抽出し，細胞の分類分けの基準となる特徴量をもとに，これに起因するタンパク質を検討し，そのタンパク質の動態をライブイメージングすることで，細胞運命を決める機構について考察する．また，アクチン線維と非筋ミオシンIIの分布や動態を高分解能顕微鏡でライブイメージングし，融合する細胞と融合を受ける細胞，２細胞間の力学的環境の違いに起因した細胞骨格形成を検証し，細胞膜融合を促進する機構を考察していく．
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、次の２つのテーマから筋細胞融合を統合的に理解することを目的にしている。１）機械学習を用いた細胞セグメンテーション解析とクラスタリング解析から、融合する筋細胞の特徴抽出を行い、その特徴に介在するタンパク質動態の検討から、筋芽細胞から融合する筋細胞への融合過程における分子機構を理解する。２）融合界面における細胞骨格やミオシンの動態観察から融合の力学的な機構を理解する。
１）のテーマに関して、細胞のセグメンテーション解析から融合する筋細胞においては、未融合の筋細胞と比較して、明らかに面積が大きく、アスペクト比が大きい（細長い）形状であり、速度が低い特徴が明確となった。また、一方の細胞からの膜の貫入により融合が始まると考えられているので、融合する細胞においては膜の硬さが低下している可能性があると考え、膜の硬さに依存して蛍光量が変化する蛍光プローブを用いた予備実験を行ったところ、融合した細胞では膜の硬さが低下している可能性が示唆された。こうした特徴に起因する分子機構の解明を目指し、バキュロウイルスを用いて非筋ミオシンII-mCherryの発現条件を検討していきたが、まだ検討が必要である。2)のテーマに関しては、細胞骨格筋であるアクチンの明確な貫入をマウスから採取した筋細胞では確認できていない。一方、融合時における細胞質の移動を蛍光プローブを用いて可視化し、"融合する"細胞から"融合を受ける"細胞への細胞質流入による融合界面における蛍光量変化の時定数を求めたところ、20分前後の極めて遅い値であった。この結果は通常の細胞質粘性から予想される時定数（t<数秒）より遥かに大きい値であり、流動性を下げる何らかの要因があることが判明した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
予想以上に難航しているのは、融合する細胞の形態や運動性に大きく関わっていると考えられる非筋ミオシンの可視化の作業である。バキュロウイルスによる非筋ミオシン-mCherryの発現条件を検討してきたが、ウイルス濃度を上げて発現量を上げると死滅する筋細胞が多く、濃度を下げると死滅する細胞は激減したが、ミオシン動態を十分可視化できる発現量に至らず、最適な条件に至っていない。ただ、十分な条件検討できてなく、今後は十分な条件検討を実施する。一方で、２つの興味深い実験結果を得た。１つ目は、融合細胞と単独の細胞の膜の硬さをFlipper-TRという膜の硬さに依存して蛍光寿命が変化するプローブを用いて、蛍光寿命イメージング顕微鏡で計測した結果である。まだ予備実験のみであるが、単独の筋細胞と比較して、融合細胞では膜が柔らかい可能性が見えてきた。こうした膜張力の変化は、融合に際して重要な力学的特徴の変化であると共に、融合細胞がより細長い形状で形態を維持する要因であるかもしれない。２つ目は、融合する細胞間の界面における細胞質の時定数が通常の細胞質から予想される値より遥かに大きい結果を得たことである。これら２つの結果に関しては、今後さらに計測を重ねて、再現性の確認、またその要因を検証する必要性がある。以上、現状においては、ミオシン可視化に向けた発現条件の検討や更なる実験検証が必要であるため、本研究の目的を遂行するには、やや遅れていると感じている。
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| Strategy for Future Research Activity |
進捗状況の欄で述べた通り、次の3点から今後は進めていく。1) 筋細胞におけるタンパク質発現条件においては、タンパク質の発現量と細胞死との間で程よい加減となるバキュロウイルスの濃度条件を決定していく。2) Flipper-TRを用いた蛍光寿命イメージング計測は引き続き行い、統計的に十分な測定量をえることで、融合細胞における膜の硬さの変化を明確に検討していく。3) 融合界面における細胞質の流動性においても、引き続き計測を増やすとともに、より明確に細胞質の流動性を可視化しるために、細胞質内に重合した状態で蛍光タンパク質を発現させる方法なども検討する。
上記の点を検証することで、融合する細胞の動きや形態の特徴を明確にすると共に、その特徴に寄与するタンパク質が細胞内でどのように活動しているのか明確にしていく。
また、細胞膜の硬さに融合前の細胞と融合する細胞に差異が見られるなら、力学的な観点から、安定した細胞形状を予想することができるはずであり、「なぜ、融合した細胞は全方向に広がるのではなく、細長くなり最終的には筋菅や筋線維に見られるような一方向に進展したファイバー状の形態をとるのか」理解できると期待している。
細胞界面における予想外に低い細胞質流動性については、申請者が知る限り、これまで報告はなく、新しい発見の可能性もあり、より詳細な解析とともに、その機構の解明を目指して、この1年でしっかりと検証していく。
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