• Search Research Projects
  • Search Researchers
  • How to Use
  1. Back to previous page

クライオ電子顕微鏡による細菌べん毛輸送中間複合体の構造解析

Research Project

Project/Area Number 22K06162
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (C)

Allocation TypeMulti-year Fund
Section一般
Review Section Basic Section 43040:Biophysics-related
Research InstitutionOsaka University

Principal Investigator

木下 実紀  大阪大学, 大学院生命機能研究科, 特任助教(常勤) (30790985)

Project Period (FY) 2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Keywords電子顕微鏡 / 細菌 / 蛋白質 / 遺伝学 / 感染症
Outline of Research at the Start

べん毛輸送装置はATPと細胞膜を隔てた電位差すなわち膜電位を利用してべん毛構成タンパク質を輸送します。これまでに、ATPase複合体が輸送ゲートタンパク質FlhAやFlhBに結合しATPを加水分解すると、輸送ゲートが開き、輸送基質タンパク質が水素イオン(H+)の内向きの流れに共役して輸送チャネル内を拡散移動すること発見しました。本研究では、クライオ電子顕微鏡による立体構造解析と遺伝学・生化学的解析を上手く組み合わせることで、個々の輸送ゲート構成タンパク質がどのように時間的および空間的に作動してH+の内向きの流れに共役したタンパク質輸送というダイナミックな機能を実現するのかを明らかにします。

Outline of Annual Research Achievements

べん毛輸送ゲート複合体は、プロトンの内向きの流れに共役してべん毛構成タンパク質を細胞外へ送り出す。これまでに、熱揺らぎの影響を強く受けるにもかかわらず、輸送ゲート複合体にはべん毛構成タンパク質が高速かつ高効率に細胞外方向へのみ拡散移動できるしくみが装備されているが、その実体は未だ謎である。本研究では、クライオ電子顕微鏡を用い、輸送ゲート複合体部分を高分解能構造解析することで、熱揺らぎをうまく取り入れながら高速・高効率に輸送基質タンパク質を輸送できる輸送チャネル複合体の構造基盤を解明することを目的とする。本年度の主な成果は以下に示す。
1. 精製したFliPQR-FlhB複合体はFlhBの細胞質ドメインがFliPQR複合体と相互作用することによりダイマーを形成した。クライオ電子顕微鏡によりFliPQR-FlhB複合体の構造解析を行なった結果、FlhBに対応する電子密度が観察された。輸送基質蛋白質が輸送ゲート複合体に結合した輸送中間複合体の精製にも成功した。
2. FliFのペリプラズム領域にはRBM1, RBM2, RBM3と呼ばれるモチーフが存在し、RBM2-RBM2分子間相互作用およびRBM3-RBM3分子間相互作用によりMSリングが形成される。輸送ゲート複合体はRBM2リングの中心孔に組み込まれて機能する。FliFを輸送ゲート構成蛋白質やCリング蛋白質と共発現させ、ショ糖密度勾配遠心法によりMSリング複合体を精製した。精製標品をクライオ電子顕微鏡により構造解析を行なった結果、3.1Å分解能でRBM2リングの原子モデルを構築した。得られた原子モデルに基づいて変異体解析を行なった結果、RBM2のi-loopと名づけたループ領域がFliPおよびFliRと直接相互作用することにより、輸送ゲート複合体がRBM2リングの内部に安定に組み込まれることが示唆された。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

クライオ電子顕微鏡により、輸送ゲート複合体が組み込まれる場所として働くFliFのRBM2リングの形成メカニズムを明らかにするとともに、FliPQR-FlhB複合体の原子モデルの構築も可能となった。さらに、輸送中間複合体の精製にも成功した。

Strategy for Future Research Activity

クライオ電子顕微鏡によりFliPQR-FlhB複合体および輸送中間複合体の構造解析を進める。得られた原子モデルに基づいて変異体解析を行い、輸送ゲート複合体の作動メカニズムを明らかにする。

Report

(2 results)
  • 2023 Research-status Report
  • 2022 Research-status Report
  • Research Products

    (25 results)

All 2024 2023 2022 Other

All Int'l Joint Research (2 results) Journal Article (7 results) (of which Peer Reviewed: 7 results,  Open Access: 6 results) Presentation (14 results) (of which Invited: 2 results) Remarks (2 results)

  • [Int'l Joint Research] ユタ大学(米国)

    • Related Report
      2023 Research-status Report
  • [Int'l Joint Research] ユタ大学(米国)

    • Related Report
      2022 Research-status Report
  • [Journal Article] FliH and FliI help FlhA bring strict order to flagellar protein export in Salmonella2024

    • Author(s)
      Kinoshita Miki、Minamino Tohru、Uchihashi Takayuki、Namba Keiichi
    • Journal Title

      Communications Biology

      Volume: 7 Issue: 1 Pages: 336-336

    • DOI

      10.1038/s42003-024-06081-0

    • Related Report
      2023 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Structure, Assembly, and Function of Flagella Responsible for Bacterial Locomotion2023

    • Author(s)
      Minamino Tohru、Kinoshita Miki
    • Journal Title

      EcoSal Plus

      Volume: 11 Issue: 1

    • DOI

      10.1128/ecosalplus.esp-0011-2023

    • Related Report
      2023 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Purification of the Transmembrane Polypeptide Channel Complex of the Salmonella Flagellar Type III Secretion System2023

    • Author(s)
      Kinoshita Miki、Namba Keiichi、Minamino Tohru
    • Journal Title

      Methods in Molecular Biology

      Volume: 2646 Pages: 3-15

    • DOI

      10.1007/978-1-0716-3060-0_1

    • ISBN
      9781071630594, 9781071630600
    • Related Report
      2022 Research-status Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Insight Into Distinct Functional Roles of the Flagellar ATPase Complex for Flagellar Assembly in Salmonella2022

    • Author(s)
      Minamino Tohru、Kinoshita Miki、Namba Keiichi
    • Journal Title

      Frontiers in Microbiology

      Volume: 13 Pages: 864178-864178

    • DOI

      10.3389/fmicb.2022.864178

    • Related Report
      2022 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] 細菌べん毛輸送装置の膜電位に依存した活性化機構2022

    • Author(s)
      南野徹, 木下実紀, 森本雄祐, 難波啓一
    • Journal Title

      生物物理

      Volume: 62 Pages: 165-169

    • Related Report
      2022 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Conserved GYXLI Motif of FlhA Is Involved in Dynamic Domain Motions of FlhA Required for Flagellar Protein Export2022

    • Author(s)
      Minamino Tohru、Kinoshita Miki、Inoue Yumi、Kitao Akio、Namba Keiichi
    • Journal Title

      Microbiology Spectrum

      Volume: 10 Issue: 4

    • DOI

      10.1128/spectrum.01110-22

    • Related Report
      2022 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Activation mechanism of the bacterial flagellar dual-fuel protein export engine2022

    • Author(s)
      Minamino Tohru、Kinoshita Miki、Morimoto Yusuke V.、Namba Keiichi
    • Journal Title

      Biophysics and Physicobiology

      Volume: 19 Issue: 0 Pages: n/a

    • DOI

      10.2142/biophysico.bppb-v19.0046

    • ISSN
      2189-4779
    • Related Report
      2022 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] サルモネラ直線型べん毛繊維L型とR型の高分解能構造比較2024

    • Author(s)
      牧野文信, Kasim Waraichi, 木下実紀, 宮田知子, 南野徹, 難波啓一
    • Organizer
      べん毛研究交流会
    • Related Report
      2023 Research-status Report
  • [Presentation] 海洋ビブリオ菌の極べん毛モーターFliFG融合タンパク質からなるMSリングの構造と性状2024

    • Author(s)
      竹川宜宏, 錦野達郎, 岸川淳一, 廣瀬未果, 木下実紀, 小嶋誠司, 南野徹, 内橋貴之, 今田勝巳, 本間道夫
    • Organizer
      べん毛研究交流会
    • Related Report
      2023 Research-status Report
  • [Presentation] べん毛輸送ATPase FliI 6量体の構造変化2024

    • Author(s)
      竹川宜宏, 碓井亜瑳子, 多治見祐希, 内橋貴之, 木下実紀, 南野徹, 今田勝巳
    • Organizer
      べん毛研究交流会
    • Related Report
      2023 Research-status Report
  • [Presentation] CryoEM structure of the polypeptide channel complex of the bacterial flagellar type III secretion system (べん毛 III 型分泌装置のポリペプチドチャネル複合体のクライオ電子顕微鏡構造)2023

    • Author(s)
      Kinoshita M, Miyata T, Makino F, Kato T, Imada K, Namba K, Minamino T.
    • Organizer
      日本生物物理学会
    • Related Report
      2023 Research-status Report
  • [Presentation] Proton-protein antiporter mechanism in the type III secretion system of the bacterial flagellum (細菌べん毛の III 型分泌システムにおけるプロトン-タンパク質アンチポーター機構)2023

    • Author(s)
      Minamino T, Kinoshita M, Namba K.
    • Organizer
      日本生物物理学会
    • Related Report
      2023 Research-status Report
    • Invited
  • [Presentation] CryoEM structure of the ATPase ring complex of the flagellar type III export apparatus(べん毛III型輸送ATPase複合体のcryoEM構造)2023

    • Author(s)
      Usui A, Kinoshita M, Tajimi Y, Uchihashi T, Minamino T, Takekawa N, Imada K.
    • Organizer
      日本生物物理学会
    • Related Report
      2023 Research-status Report
  • [Presentation] 阪大生命機能研究科での in situ 構造解析への取り組み - クライオ FIB-SEMからクライオTEMへ2023

    • Author(s)
      宮田知子, 木下実紀, 串間由江, 山内玲子, 牧野文信, 難波啓一.
    • Organizer
      日本顕微鏡学会
    • Related Report
      2023 Research-status Report
    • Invited
  • [Presentation] べん毛T3SS ATPaseの構造変化2023

    • Author(s)
      碓井亜瑳子, 多治見祐希, 内橋貴之, 木下実紀, 南野徹, 竹川宜宏, 今田勝巳
    • Organizer
      生命分子科学研究会
    • Related Report
      2023 Research-status Report
  • [Presentation] 原発性繊毛運動不全症の原因因子 Dpcdの機能構造の解析2023

    • Author(s)
      小枝日向子, 木下 実紀, 守島健, 井上倫太郎, 杉山正明, 養王田正文, 今田勝巳, 篠原恭介
    • Organizer
      日本生化学会
    • Related Report
      2023 Research-status Report
  • [Presentation] Role of the cytoplasmic ATPase complex in export switching of the flagellar protein export apparatus.2023

    • Author(s)
      Minamino T, Kinoshita M, Namba K.
    • Organizer
      日本細菌学会
    • Related Report
      2022 Research-status Report
  • [Presentation] ビブリオ菌由来のFliKとFlhBはサルモネラのIII型輸送装置の基質特異性を切り替えることができる. Vibrio FliK and FlhB homologs can switch the substrate specificity of the Salmonella type III protein export apparatus.2023

    • Author(s)
      南野徹, 木下実紀, 難波啓一
    • Organizer
      べん毛研究交流会
    • Related Report
      2022 Research-status Report
  • [Presentation] サルモネラIII型輸送装置のポリペプチドチャネル複合体の形成機構. Assembly mechanism of the polypeptide channel complex of the Salmonella type III protein export apparatus.2023

    • Author(s)
      木下実紀, 宮田知子, 牧野文信, 難波啓一, 南野徹.
    • Organizer
      べん毛研究交流会
    • Related Report
      2022 Research-status Report
  • [Presentation] Highly conserved GYXLI motif of FlhA is directly involved in hierarchical flagellar protein export in Salmonella.2022

    • Author(s)
      Minamino T, Kinoshita M, Namba K.
    • Organizer
      日本生物物理学会
    • Related Report
      2022 Research-status Report
  • [Presentation] べん毛 III 型輸送 ATPase 複合体の構造変化と作動機構 (Structural change of the ATPase ring complex of the flagellar Type III export apparatus).2022

    • Author(s)
      Usui A, Yano T, Tajima Y, Takekawa N, Kinoshita M, Minamino T, Uchihashi T, Imada K.
    • Organizer
      日本生物物理学会
    • Related Report
      2022 Research-status Report
  • [Remarks]

    • URL

      https://www.fbs.osaka-u.ac.jp/ja/research_group/detail/24

    • Related Report
      2023 Research-status Report
  • [Remarks]

    • URL

      https://www.fbs.osaka-u.ac.jp/ja/research_group/detail/24

    • Related Report
      2022 Research-status Report

URL: 

Published: 2022-04-19   Modified: 2024-12-25  

Information User Guide FAQ News Terms of Use Attribution of KAKENHI

Powered by NII kakenhi