Conformation of protein bound to membrane characterized by time-resolved vacuum-ultraviolet circular dichroism spectroscopy
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22K06163
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 43040:Biophysics-related
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
松尾 光一 広島大学, 放射光科学研究センター, 准教授 (40403620)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
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| Keywords | 円二色性 / 時間分解 / 放射光 / タンパク質 / 生体膜 / 膜結合タンパク質 / 構造変化 |
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| Outline of Research at the Start |
放射光を用いた円二色性法は，生体膜存在下などの様々な溶媒環境下で，蛋白質の天然と膜結合構造の高精度解析が可能である。本研究では，蛋白質の天然から膜結合構造に至るまでの速度や中間体の形成を観測するため，マイクロ流路を用いた時間分解セルを開発し，サブミリ秒レベルで構造変化を追跡できる円二色性計測システムを構築する。膜内への薬物輸送や膜の安定化などに関わる蛋白質の膜結合構造やその構造の形成過程を精密に解析する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
生体膜との相互作用による水溶性タンパク質のダイナミックな構造変化は，生体膜上で様々な生命機能や物性を誘発する。この構造変化と機能との関係を理解するには，タンパク質の天然と膜結合構造を理解するだけでなく、天然から膜結合構造に至る過程（速度・中間構造）を詳細に捉える必要がある。本研究では、膜結合性タンパク質の構造解析法として有効な手法である真空紫外円二色性分光法に、時間分解機能を持たせることで、生体膜相互作用によるタンパク質の構造変化（構造ダイナミクス）の観測を試みた。時間分解のために膜結合タンパク質溶液と生体膜溶液を高効率かつ高速で混合可能な特殊なマイクロ流路時間分解セルを開発し、相互作用中のタンパク質構造変化を観測した。膜結合タンパク質には、生体膜相互作用研究のモデルタンパク質であるbetaラクトグロブリン(bLG)を使用した。生体膜には、溶液中でミセルを形成するリゾリン脂質(LysoDMPG)と界面活性剤であるSodium Dodecyl Sulfate(SDS)を使用した。構築した時間分解装置により、LysoDMPG相互作用では1～60秒、SDS相互作用では0.1～90秒の時間分解CDスペクトルの獲得することができた。CD値の時間変化をグローバルフィッティングすることで2つの速度定数が算出され、各相互作用で1つの中間状態の存在と、生体膜の種類に依存した膜結合状態の形成速度が確認された。以上より構築した時間分解装置が生体膜相互作用過程の動的構造の研究に応用できることが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本研究では、時間分解装置の予備的な開発と、この装置の放射光計測機への実装が実施された。また、時間分解セルと光学システムの評価も標準試料を用いて実施された。これらのシステムを用いて、実際にモデルタンパク質の膜相互作用実験を行い、構造変化に依存する円二色性スペクトルを観測することに成功した。さらに、本システムを利用した他の生体膜との相互作用研究も進んでいる。また、時間分解装置の高度化に着手しおり、必要なシミュレーション技術を習得している。これにより、当初の計画以上に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、予備的に開発した時間分解システムを用いて、モデルタンパク質以外で、生体膜との相互作用により重要な機能や物性をもつタンパク質の構造変化研究に応用していく。現在、alpha1酸性糖蛋白質（AGP）の膜相互作用研究を実施する予定である。AGPはalpha→beta構造転移により，保持した薬物を放出することで，膜内への薬物輸送を促すと知られている。開発したTRセルを用いて、AGP と生体膜溶液を高速混合し，サブミリ秒以後の時間分解CD スペクトルを観測し，得られたスペクトルの主成分分析などから，中間体の形成や膜結合速度を解析する。また中間体のVUVCD スペクトルから，二次構造含量・本数・配列を解析する。またHPLC により各種の膜結合状態のAGP の薬物(プロゲステロン)結合能を決定し，AGP の膜結合構造との関連性について明確にする予定である。
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Report
(1 results)
Research Products
(24 results)
