電気生理-蛍光変化同時計測系によるプロトンチャネルの制御機構解析

• Project/Area Number: 22K06170
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 43040:Biophysics-related
• Research Institution: Kagawa University
• Principal Investigator: 川鍋 陽 香川大学, 医学部, 講師 (10707128)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000); Fiscal Year 2024: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000); Fiscal Year 2023: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000); Fiscal Year 2022: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
• Keywords: イオンチャネル / 電位依存性イオンチャネル / 電位依存性プロトンチャネル / ATP / 電気生理学 / パッチクランプ / 電位依存性

Outline of Research at the Start

細胞膜のイオン透過を担う“イオンチャネル”は、細胞内のさまざまな小分子により制御を受けるが、その制御機構は細胞内であるが故に研究が困難である。我々は最近、膜電位に応じてプロトンを透過する電位依存性プロトンチャネルHv1において、細胞内側の“ATP”が制御因子である可能性を見出した。そこで、本研究ではHv1の制御因子となる細胞内分子の相互作用部位および作用機序を明らかにすることを目的としている。そのためにATP効果の定量測定・変異体による機能解析・非天然蛍光アミノ酸を用いた細胞内側構造変化解析を行う。これらの結果を基にして最終的に生理的意義の理解へと繋げる。

Outline of Annual Research Achievements

前年度、電気生理学的解析により電位依存性プロトンチャネルHv1に対してATPが直接作用することで機能を制御していることを明らかにした。
本年度は、どのような原因でHv1電流がATPにより増強されるのかを定量的に検討した。想定される原因として、①活性化速度の増加、②電位依存性のシフト、③単一チャネル電流の増大、などが挙げられる。Hv1はもともと活性化が非常に遅いことが知られているが(時定数にして~30秒)、ATPにより活性化が速くなることが確認された(時定数：~10秒)。続いて、電位依存性シフトを検討するために、各電位の定常状態電流をプロットしたところ、ATPによる大きな変化は観測されなかった。また、各電位の定常状態電流の値はATPの有無では大きく変動しなかったことから単一チャネル電流にも影響を与えないことが判明した。従って、ATPの効果は、Hv1の活性化速度に影響を与えるものと考えられた。
電気生理学的解析ではATPが直接作用することが示唆されたが、実際に相互作用しているかどうかは検討できない。そこでわれわれは、マイクロスケール熱泳動法(MST)を使用することで直接相互作用を検討した。N末端、C末端を切断した精製Hv1(T57-I224)とATPアナログ(ATP, ADP, AMP, Adenosine)の結合を評価したところ、Adenosine以外で相互作用が確認された。また、その結合の強さは、ATP > ADP > AMP >> Adenosineであった。この序列は、電気生理におけるHv1への効果の強さと同じ傾向であった。つまり、電気生理の結果と総合すると、ATPはHv1に対して直接相互作用をすることで、機能を制御することが判明した。
以上の結果をまとめて、原著論文としてJournal of Physiologyに報告した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度は、当初の計画通り電位依存性プロトンチャネルHv1のATPの効果の詳細を検討し、直接相互作用を検証した。これらの内容をまとめて論文に投稿・受理されたため、研究実施状況はおおむね順調に進んでいると評価した。

Strategy for Future Research Activity

本年度の研究成果から、ATPはHv1に直接相互作用することで効果を発揮することが示された。しかし、相互作用部位の特定までには至らなかった。今後変異体解析などを通して、ATPの相互作用部位の特定を行う一方で、シミュレーションなども組み合わせることでATP作用の検証も行う。
また、電流―蛍光同時リアルタイム計測システムを用いて、細胞内側に導入した非天然蛍光アミノ酸Anapと蛍光ATPアナログとのFRETから、相互作用を検討する実験系も試みる。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Israel Institute of Technology/Weizmann Institute of Science/The Hebrew University of Jerusalem(イスラエル)
• [Int'l Joint Research] Humboldt-Universitat zu Berlin(ドイツ)
• [Journal Article] Sugar binding of sodium-glucose cotransporters analyzed by voltage-clamp fluorometry (2024)
  • Author(s): Watabe Erika、Kawanabe Akira、Kamitori Kazuyo、Ichihara Satoko、Fujiwara Yuichiro
  • Journal Title: Journal of Biological Chemistry Volume: 300 Issue: 5 Pages: 107215-107215
  • DOI: 10.1016/j.jbc.2024.107215
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] ATP modulates the activity of the voltage‐gated proton channel through direct binding interaction (2023)
  • Author(s): Kawanabe Akira、Takeshita Kohei、Takata Maki、Fujiwara Yuichiro
  • Journal Title: The Journal of Physiology Volume: 601 Issue: 18 Pages: 4073-4089
  • DOI: 10.1113/jp284175
• [Journal Article] Rhodopsin-bestrophin fusion proteins from unicellular algae form gigantic pentameric ion channels (2022)
  • Author(s): Rozenberg A,Kaczmarczyk I,Matzov D,Vierock J,Nagata T,Sugiura M,Katayama K,Kawasaki Y,Konno M,Nagasaka Y,Aoyama M,Das I,Pahima E,Church J,Adam S,Borin VA,Chazan A,Augustin S,Wietek J,Dine J,Peleg Y,Kawanabe A,Fujiwara Y,Yizhar O,Sheves M,Schapiro I,Furutani Y,Kandori H,Inoue K,Hegemann P,Beja O,Shalev-Benami M.
  • Journal Title: Nature Structural & Molecular Biology Volume: 29 Issue: 6 Pages: 592-603
  • DOI: 10.1038/s41594-022-00783-x
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Interaction between S4 and the phosphatase domain mediates electrochemical coupling in voltage-sensing phosphatase (VSP) (2022)
  • Author(s): Mizutani Natsuki、Kawanabe Akira、Jinno Yuka、Narita Hirotaka、Yonezawa Tomoko、Nakagawa Atsushi、Okamura Yasushi
  • Journal Title: Proceedings of the National Academy of Sciences Volume: 119 Issue: 26 Pages: 2200364119-2200364119
  • DOI: 10.1073/pnas.2200364119
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Intermolecular functional coupling between phosphoinositides and the potassium channel KcsA (2022)
  • Author(s): Kiya Takunari、Takeshita Kohei、Kawanabe Akira、Fujiwara Yuichiro
  • Journal Title: Journal of Biological Chemistry Volume: 298 Issue: 8 Pages: 102257-102257
  • DOI: 10.1016/j.jbc.2022.102257
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] The effects of hydrogen sulfide on the voltage-gated potassium channels (2024)
  • Author(s): Akira Kawanabe, Yuichiro Fujiwara
  • Organizer: 第101回日本生理学会大会
• [Presentation] Arachidonic acid regulates the voltage sensor activation in the voltage-gated H+ channels (2024)
  • Author(s): Takata Maki, Kohei Takeshita, Akira Kawanabe, Yuichiro Fujiwara
  • Organizer: 第101回日本生理学会大会
• [Presentation] Functional regulation of the voltage-gated proton channel (2023)
  • Author(s): Akira Kawanabe, Yuichiro Fujiwara
  • Organizer: 第61回日本生物物理学会
  • Invited
• [Presentation] Direct interaction between the voltage-gated proton channel and ATP (2023)
  • Author(s): Akira Kawanabe, Maki Takata, Kohei Takeshita and Yuichiro Fujiwara
  • Organizer: 第100回日本生理学会大会
• [Presentation] Functional regulation of phosphoinositides to the potassium channel KcsA (2023)
  • Author(s): Takunari Kiya, Kohei Takeshita, Akira Kawanabe, Yuichiro Fujiwara
  • Organizer: 第100回日本生理学会大会
• [Presentation] Mechanisms of voltage-depndent H+ channel activity regulated by membrane stretch and lipids (2023)
  • Author(s): Takata Maki, Kohei Takeshita, Akira Kawanabe, Yuichiro Fujiwara
  • Organizer: 第100回日本生理学会大会
• [Presentation] ATPは電位依存性プロトンチャネルHv1に直接結合して活性を制御する (2022)
  • Author(s): 川鍋陽、竹下浩平、高田麻紀、藤原祐一郎
  • Organizer: 生理研研究会「構造情報を基盤とした膜機能分子の生理機能理解に向けて」
• [Presentation] カリウムチャネルKcsAとイノシトールリン脂質の分子間相互作用と機能修飾 (2022)
  • Author(s): 紀谷拓音、竹下浩平、川鍋陽、藤原祐一郎
  • Organizer: 生理研研究会「構造情報を基盤とした膜機能分子の生理機能理解に向けて」
• [Presentation] Intracellular ATP controls the voltage-gated proton channel (2022)
  • Author(s): Akira Kawanabe, Maki Takata and Yuichiro Fujiwara
  • Organizer: 第60回日本生物物理学会
• [Presentation] Toward an analysis of the effects of hydrogen sulfide on the voltage-gated potassium channel (2022)
  • Author(s): Akira Kawanabe and Yuichiro Fujiwara
  • Organizer: 4th International Conference on Persulfide and Sulfur Metabolism in Biology and Medicine
  • Int'l Joint Research
• [Remarks] 香川大学医学部分子生理学講座ホームページ
  • URL: https://www.med.kagawa-u.ac.jp/~physiology1/index.html
• [Remarks] 香川大学医学部 分子生理学講座
  • URL: https://www.med.kagawa-u.ac.jp/~physiology1/index.html