電気生理-蛍光変化同時計測系によるプロトンチャネルの制御機構解析
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22K06170
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 43040:Biophysics-related
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| Research Institution | Kagawa University |
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Principal Investigator |
川鍋 陽 香川大学, 医学部, 講師 (10707128)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
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| Keywords | イオンチャネル / 電位依存性 / 電位依存性プロトンチャネル / 電気生理学 / パッチクランプ / ATP / 電位依存性イオンチャネル |
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| Outline of Research at the Start |
細胞膜のイオン透過を担う“イオンチャネル”は、細胞内のさまざまな小分子により制御を受けるが、その制御機構は細胞内であるが故に研究が困難である。我々は最近、膜電位に応じてプロトンを透過する電位依存性プロトンチャネルHv1において、細胞内側の“ATP”が制御因子である可能性を見出した。そこで、本研究ではHv1の制御因子となる細胞内分子の相互作用部位および作用機序を明らかにすることを目的としている。そのためにATP効果の定量測定・変異体による機能解析・非天然蛍光アミノ酸を用いた細胞内側構造変化解析を行う。これらの結果を基にして最終的に生理的意義の理解へと繋げる。
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者は、本研究開始前に膜電位に応じてプロトンを透過する電位依存性プロトンチャネルHv1において、細胞内側の“ATP”や“N末端ドメイン”が制御因子である可能性を見出した。そこで、Hv1の制御因子となる細胞内分子・ドメインの相互作用部位および作用メカニズムを明らかにすることを目的としている。
本年度は、Hv1に対するATP効果の定量化を目的として、電気生理学的実験を実施した。ATPの効果を定量化するために、細胞膜から膜の一部を切り取ったインサイドアウト膜を形成した上で、細胞内側からATP濃度を調整しながら、Hv1のプロトン電流の計測を行った。その結果、生理的なATP濃度(2mM)で電流上昇効果があることが判明した。さらなる高濃度での測定も実施したが電流は上昇し続け、20mMでも飽和することはなかった(これ以上は測定できていない)。続いて、このATP効果が、直接的・間接的のどちらであるのか検討するために、ATPアナログによる電流への効果の定量を行った。ATPは、生体内で重要な生理作用をいくつも担うために他のイオンチャネルでは間接的な影響を与えることが多く(特にイノシトールリン脂質PI(4,5)P2の代謝に関わる)、このような評価は大変重要となる。Adenosine, AMP, ADP, ATPと効果を検証すると、リン酸基が多いものほど効果が大きいことが明らかとなった。また、ATPの代謝不活化型アナログであるAMP-PCPを用いた所、ATPと同等の効果が得られた。以上の事から、ATPはHv1に対して直接的に作用することで、影響を与えていると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、当初の計画通り電位依存性プロトンチャネルHv1のATPの効果を定量化するべく、電気生理学的解析を行った。これらの内容をまとめて論文を作成中であり、研究実施状況はおおむね順調に進んでいると評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度の研究成果から、ATPはHv1に直接作用して効果を発揮することが示された。しかし、実際に直接相互作用しているのかを電気生理学的には評価することができない。そこで、今後、精製イオンチャネルを使用してATPとの直接相互作用を計測する実験を計画している(マイクロスケール熱泳動法や表面プラズモン共鳴法を検討している)。
また、電流―蛍光同時リアルタイム計測システムを用いて、細胞内側に導入した非天然蛍光アミノ酸Anapと蛍光ATPアナログとのFRETから、相互作用を検討する実験系も試みる。
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Report
(1 results)
Research Products
(13 results)
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[Journal Article] Rhodopsin-bestrophin fusion proteins from unicellular algae form gigantic pentameric ion channels2022
Author(s)
Rozenberg A,Kaczmarczyk I,Matzov D,Vierock J,Nagata T,Sugiura M,Katayama K,Kawasaki Y,Konno M,Nagasaka Y,Aoyama M,Das I,Pahima E,Church J,Adam S,Borin VA,Chazan A,Augustin S,Wietek J,Dine J,Peleg Y,Kawanabe A,Fujiwara Y,Yizhar O,Sheves M,Schapiro I,Furutani Y,Kandori H,Inoue K,Hegemann P,Beja O,Shalev-Benami M.
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Journal Title
Nature Structural & Molecular Biology
Volume: 29
Issue: 6
Pages: 592-603
DOI
Related Report
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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