光活性化cAMP産生酵素の高時間分解能活性計測を基盤とした光遺伝学ツールの創製
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22K06173
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 43040:Biophysics-related
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
平野 美奈子 岡山大学, ヘルスシステム統合科学学域, 准教授 (80585167)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
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| Keywords | 光遺伝学 / イオンチャネル |
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| Outline of Research at the Start |
近年、光照射によりcAMPを産生する天然の光活性化アデニル酸シクラーゼ（PAC）が細胞機能の光操作のツールとして注目されているが、その特性が正確に評価されていないため、PACの選択が限定され活用が進んでいない。本研究では、cAMP依存的に開閉するイオンチャネル（CNGチャネル）を利用して、PACが産生するcAMPの絶対量変化を高時間分解能で捉えて特性の調整機構を解明し、その部位を改変して細胞機能の光操作に適した新規PAC改変体群を創製する。本研究によりPACの細胞機能の光操作ツールとしての汎用性を高め、様々な生命現象の機序の理解や疾患の原因の解明へと繋げたい。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、cAMP依存的に開閉するイオンチャネル（CNGチャネル）を利用して、光活性化アデニル酸シクラーゼ（PAC）の特性の調整機構を解明し、細胞機能の光操作に適した新規PAC改変体群を創製することを目的としている。本年度は、PACが産生するcAMP量を捉えるのに適したCNGチャネルの選定を行った。詳細を下記に記す。
CNGチャネルの一種であるHCN2チャネルとSthKチャネルのcAMP感受性を比較した。これらのCNGチャネルをアフリカツメガエルの卵母細胞にそれぞれ発現させ、細胞内cAMP濃度の変化に伴うチャネル電流の変化を計測した。HCN2チャネルを発現させた卵母細胞では、フォルスコリンの添加または共発現させたPACへの光刺激によってcAMP産生を促さなくてもチャネル電流が捉えられ、これらの刺激によりcAMP量を高めてもチャネル電流に変化はなかった。一方、SthKチャネルでは、フォルスコリンの添加前後でチャネル電流に変化が見られた。ELISA法によるcAMP濃度の測定により、卵母細胞内には元々約1 μMのcAMPが存在していたことから、HCNチャネルは1 μM程度のcAMPで完全に活性化されると考えられる。一方、SthKチャネルが活性化された条件での細胞内cAMP濃度は200 μM以上であったことから、SthKチャネルは数100 μM以上のcAMPが活性化に必要なことがわかった。これらのことから、PACの特性を調べる際、活性が低い、つまり産生されるcAMP量が少ない場合にはHCN2チャネルを、活性が高い場合にはSthKチャネルを用いれば、特性を捉えられることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度、PACの特性を捉えるためのCNGチャネルのcAMP濃度依存性を明らかにすることができたため、今後この情報を基にPAC毎に適した種類のCNGチャネルを使うという道筋が立った。
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| Strategy for Future Research Activity |
今回特性を調べたHCN2チャネルとSthKチャネルを昆虫細胞または大腸菌で発現・精製し、電気生理学的手法の一つである人工膜法でcAMP濃度依存的な変化が見られることを確認する。また、これら2つのCNGチャネルでカバーできないcAMP濃度を捉えるためのCNGチャネルを探し出す。その後、PACが光依存的に産生するcAMP量の変化を、人工膜に組み込んだこれらのCNGチャネルのチャネル電流の変化で捉え、PACの種類の違いによる特性の違いを明らかにする。得られた情報から特性に影響を与える部位を改変し、光応答能などを高めた変異体を作製してPACのオプトジェネティクスツールとしてのバリエーションを広げる。
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Report
(1 results)
Research Products
(3 results)
