| Project/Area Number |
22K06199
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 44010:Cell biology-related
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
船越 祐司 筑波大学, 医学医療系, 准教授 (30415286)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
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| Keywords | インフラマソーム / 低分子量G蛋白質 / 炎症応答 / 炎症 |
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| Outline of Research at the Start |
インフラマソームは、病原体や内因性刺激物質を感知しサイトカイン放出を誘導する、炎症応答の中心を成す複合体である。インフラマソームはプリオン様の凝集体を形成し、細胞外へと放出され、マクロファージなどにより貪食されることで連鎖的に炎症応答を誘導し炎症を増幅させる。研究代表者らは、インフラマソームの細胞間伝播において低分子量G蛋白質Arf6とRab11が主要な役割を果たすことを示す予備的知見を得ている。本研究では、インフラマソームの細胞外への放出、およびマクロファージなどによる取り込みにおけるArf6、Rab11の機能を解析することにより、インフラマソームの細胞間伝播メカニズムを明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
インフラマソームは、病原体や内因性の刺激物質を感知し、サイトカイン放出を誘導することによって炎症応答を惹起・増幅させる炎症応答の中心を成す複合体である。さらに、インフラマソームはプリオン様の凝集体（ASC speck）を形成し、細胞外へと放出され、マクロファージなどにより貪食されることで連鎖的に炎症応答を誘導し炎症を増幅させる。このプリオン様のインフラマソームの細胞間伝播は過剰な炎症応答の一因であり、メカニズムの解明は重要な課題である。本年度は、ASC speckがマクロファージから放出される過程における低分子量G蛋白質の機能を中心に解析を行い、以下の成果を得た。
１）令和4年度に、Rab11のノックダウンによりASC speckの放出が抑制されることを明らかにしているが、Rab11とASC speckの細胞内局在を解析したところ、両者はリサイクリングエンドソーム上で共局在することを見出した。
２）インフラマソームの活性化後、GSDMDが切断され膜へと移行しGSDMD孔が形成される。GSDMD孔はIL-1βを放出する他、細胞膜の溶解を引き起こすが、この過程でASC sepckが細胞外に放出されると考えられる。このGSDMDについてもRab11との共局在観察された。
３)一方、細胞内の輸送に関わるArfファミリー（Arf1-6）のASC speck放出への関与を検討したところ、Arf6のノックダウンによりASC speckの細胞外への放出が抑制された一方、Arf1-5のノックダウンでは放出に影響はみられなかった。
Arf6はエンドソーム－細胞膜間の輸送に関わっており、Rab11と同様膜蛋白質等のリサイクリングにおいて中心的な役割を果たす。上記の結果から、Rab11やArf6を介したリサイクリング経路がASC speckの放出に重要な役割を果たしていることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、インフラマソームのプリオン様細胞間伝搬メカニズムの解明を目指しており、炎症応答時にASC speckがマクロファージから放出され、周辺のマクロファージに貪食されて新たなインフラマソーム形成が誘導され、炎症が増幅するメカニズムの解明を目的とする。研究代表者らは以前に、低分子量G蛋白質Arf6がマクロファージによる細胞外ASC speckのファゴサイトーシスを促進し、炎症反応を増強させることを報告しているが、令和4年度にマクロファージがASC sepckを取り込む際にArf6を活性化するGEFを同定しており、細胞外ASC speck認識から貪食を誘導するシグナル経路の一端を明らかにしている。令和5年度は、刺激物質やウイルス感染によってマクロファージ中で形成されたASC speckが細胞外に放出されるメカニズムの解析を中心に行い、前述のようにArf6およびRab11を介したリサイクリング経路がASC speck放出に重要であることを明らかにしている。このように、ASC speckのマクロファージによる放出と貪食のそれぞれにおいて中心となる因子としてArf6、Rab11を同定し、ASC speck細胞伝搬におけるそれぞれの機能、活性制御機構の解析を進めており、残りの研究期間でインフラマソームの細胞間伝搬機構、それによる炎症増幅機構を明らかにすることは、十分に達成可能であると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究成果を基に、残りの研究期間で以下の解析を実施する。
１）Arf6を介したASC speck貪食シグナル伝達経路の解明：Arf6上流のGEFとしCytohesinファミリーを同定したが、さらに、ASC speckを認識しGEFを活性化するレセプター、また、Arf6の下流でファゴサイトーシスを誘導するエフェクター分子を同定する。さらに、貪食されたASC speckが、どのようにしてリソソームによる分解を逃れ、新たなインフラマソームを形成するのか、そのメカニズムを明らかにする。
２）ASC speckの放出におけるArf6、Rab11の機能解析：インフラマソームは直径約1～2μmの巨大な複合体であることから、通常の分泌やエキソサイトーシスではなく、細胞膜の溶解に伴って細胞外に放出されると想定されている。GSDMDがRab11と共局在することから、Rab11リサイクリングエンドソームを介してGSDMDが細胞膜に運ばれ、GSDMD孔を形成し、細胞膜の溶解に伴ってASC speckが放出されることが考えられる。そこで、GSDMDがRab11によって輸送されるのかを検証し、またその際のメカニズムも明らかにする。一方、ASC speckも放出の際にGSDMD孔近辺に輸送されることが必要と考えられることから、ASC speckの輸送におけるRab11の機能解析を行う。また、これらの過程へのArf6の関与も検討する。
３）個体における解析：Arf6やRab11、その他同定した因子のマクロファージ特異的ノックアウトマウスや阻害剤を用いて、炎症応答・増悪への関与を検討す
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