| Project/Area Number |
22K06201
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 44010:Cell biology-related
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
岡本 和子 広島大学, 両生類研究センター, 助教 (40710265)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
奥田 覚 金沢大学, ナノ生命科学研究所, 准教授 (80707836)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2023: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
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| Keywords | 1分子計測 / 粘弾性 / 核内動態 / 転写因子 / クロマチン / 相分離 / 単一粒子追跡 |
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| Outline of Research at the Start |
クロマチン構造と核タンパク質の動態は密接に関与し、細胞状態を変える。ES細胞においても、分化が進むにつれクロマチンが凝集し、未分化維持に寄与する転写因子Nanog を含む多くの核タンパク質動態を変える。この凝集を制御する要因として、近年核中の粘弾性が着目されている。しかしながら核中を含む細胞内の粘弾性の定量計測系は未熟であり、計測系の開発は不可欠である。これまで、Nanogの分子動態がクロマチン構造に依存し変わることを明らかにしてきた。ここで粘弾性の定量計測系を開発し、粘弾性の変化がクロマチン構造を通して、転写因子動態を変え、最終的に未分化・分化の維持に寄与することを実験的に証明する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
胚性幹細胞(ES細胞)の未分化維持機構のなかで、Ground Stateと呼ばれる最も未分化性の高い特別な幹細胞状態を支える分子基盤の解明は、最重要課題の一つであり、転写因子Nanogが未分化性維持に中心的に機能すると示唆されていた(Silva et al.,2009)。転写因子は、標的遺伝子の転写調節領域に結合し転写開始を調節することにより、標的遺伝子の発現量を調節すると考えられている。この転写調節領域への結合動態は、クロマチンの構造に依存する。クロマチンの格納状態と転写因子の分子動態、細胞状態を観察し、実測することにより関連性を探った。これまで、Nanogは未分化状態にあるマウスES細胞では、転写調節領域での滞留時間が短く、脱未分化が進むにつれ滞留時間が長くなる、という結果を得た。これは、転写調節領域の空間ゆらぎ(拡散性)も転写因子の発現調節機構に関与することを示唆している。先行研究によって得た1分子計測の結果を用いて粘弾的特性の変化を解析した。粘弾的特性の解析にはNanogに加え、転写調節領域の構造を緩める機能を持つパイオニアファクターと示唆されるOct4の1 分子計測の結果も用いた。MSDで表した拡散の大きさは、ラプラス領域における複素せん段弾性率を一般化ストークス-アインシュタイン関係で解釈することができ、貯蔵弾性率と損失弾性率として見積もることができる。Nanogの結合領域では脱未分化が進むにつれ流動性が減じるものの、Oct4のそれでは、同様の傾向がみられず、2つの転写因子の結合領域は異なった粘弾的特性を示す結果を得た（Okamoto et al. 2023）. よりグローバルな核内状態を可視化するためにタンパク質の性質に依存しない粘弾的特性の計測方法を確立することを目指し、前年に引き続き、蛍光ビーズを用いた単一粒子追跡法を行う実験プロトコールの作製を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
先行研究から転写因子の1分子計測結果から、結合領域の粘弾的特性を見積もることはできた。核内のグローバルな粘弾的特性を探るべく本研究課題では、蛍光ビーズを用いた単一粒子追跡法を行う予定で、機器等の選択、マイクロインジェクション手法の確立を試みている。蛍光タンパク質であっても、粘弾的特性や拡散の動態を見積もることはできる。しかしながらタンパク質を用いると、そのタンパク質の結合動態・性質に依存するため、計測出来る領域に制限ができてしまう難点の克服を目的としている。核内へのマイクロインジェクション法の確立が思うように進まず、進行としてはやや遅れ気味である。先行研究と同様にマウスES細胞を用いて試みた。マウスES細胞は比較的核が大きい細胞種でありマイクロインジェクションによるビーズの核内への導入が、比較的容易に思えたものの、ダメージには弱く安定した計測ができなかった。そこで線維芽細胞等、よりダメージに強そうな細胞種を含む多種の細胞種を用いることとした。また核が大きい細胞を探索しており、ゲノムの大きさで知られる両生類細胞などの培養細胞なども検討対象とした。またマイクロインジェクション法は比較的修練の必要な実験技術である。今後は他種のモデル細胞も利用し、ビーズ導入の手法を確立させる予定である。実験対象として最適な細胞種の検索、技術の確立に時間を要し、予定よりも遅れが出ている。また、弾性率を見積もる方法は、おおよそ確立している。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究課題では、細胞内にビーズを導入する系を確立しようとしている。これまでの実験経緯に基づき、マウスES細胞を用いていた。しかしながら手法の確立には至っていない。そこで、他の培養細胞株等を用いることを検討している。また比較的マイクロインジェクション法が広く用いられている実験対象として、モデル動物の受精卵が挙げられる。ゼブラフィッシュ、カエル、イモリなどマイクロインジェクション法を利用しているモデルは多数ある。
手法の確立を目指すべく広く動物細胞・受精卵を検討し、熟練者の教えを請う予定であり、現所属には熟練者が多く在籍していることもあり、容易にアドバイスを頂戴できる環境である。
またビーズ導入には大型の細胞が実験上都合が良い、という視点からイモリ細胞の初代培養なども行っている。マウスを含む哺乳類細胞よりも数倍大きい細胞を維持することができており、またゲノムサイズの大きさからか、核も大きい。実験に都合のいいサンプルを手に出来ず、プロトコールの作製に遅れをとっていたが、サンプルの獲得が進行しつつある。
また導入が出来た際には、最適フレームレート、蛍光プローブの褪色の計測、生細胞ゆえに起こるXY位置のズレを補正を加味した観察プロトコールを作りあげる予定である。
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