Functional analysis of ciliary transition zone by combinatorial use of expansion microscopy and super-resolution microscopy
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22K06207
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 44010:Cell biology-related
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
千葉 秀平 東北大学, 生命科学研究科, 助教 (60572493)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2022: ¥650,000 (Direct Cost: ¥500,000、Indirect Cost: ¥150,000)
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| Keywords | 超々解像イメージング / 膨張顕微鏡法 / 超解像顕微鏡 / 一次繊毛 / 繊毛内輸送 / トランジションゾーン / ゲノム編集 / 繊毛病 / 超解像イメージング / 膨張顕微鏡 |
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| Outline of Research at the Start |
生体内に存在するオルガネラの多くが光の回折限界である200nmと同等またはそれ以下のサイズである。そのため、一般的な落射蛍光顕微鏡や共焦点顕微鏡でサブオルガネラスケールの分子の挙動や配置を正確に捉えるのは困難である。本研究は超解像顕微鏡ならびに試料超解像化技術である膨張顕微鏡法を併用することで、繊毛の区画化において中心的な役割を担うことが知られるわずか250nm四方の狭小空間であるトランジションゾーン（TZ)について、その構築様式ならびに繊毛の機能的な区画化に果たす役割を明らかにすることを目的とする。本研究により、TZの破綻に起因する各種繊毛症の発症メカニズムが明らかになることが期待される。
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞外環境を受容する一次繊毛の異常は、網膜変性、嚢胞性腎症、多指などを複合的に呈する先天性疾患 (繊毛病)の発症と密接に関連する。繊毛内腔と細胞質の境界面に位置するトランジションゾーン（TZ）は、繊毛内外の物質交換を制御する拡散障壁またはゲートとして、繊毛内環境の確立・維持を担うことが知られる。TZの構成分子として、これまでに多くの可溶性または膜貫通タンパク質が同定されており、その全てが少なくとも1つ以上の繊毛病で変異している。こうした点から、TZを構成する分子の詳細な役割を明らかにすることは医学的な意味で重要といえるが、TZ構成分子間の相互作用機構や個々の分子の詳細な機能は不明のままである。本研究の目的は、超々解像マルチカラーイメージング (膨張顯微鏡法と超解像顯微鏡を併用する方法)を駆使して明らかになってきた繊毛形成過程でのTZ構築機構やその制御を担う分子システムの全貌解明を足がかりとして、繊毛の機能的区画化におけるTZの役割を明らかにし、繊毛病の発症メカニズムの理解へと繋げることである。
これまでに、超解像顕微鏡を用いてTZの構成分子の繊毛形成段階での局在を詳細に解析し、TZは繊毛形成のごく初期に各構成分子が段階的に集積して構築されることを見出した。さらに、ゲノム編集技術CRISPR-Cas9システムにより構築した各種繊毛関連分子のノックアウト (KO)細胞を用いて、TZ構成分子の繊毛基部への集積を制御する分子機構を同定することにも成功した。また、複数のTZ構成分子のKO細胞を構築し、各KO細胞について繊毛内輸送複合体や繊毛局在タンパク質の繊毛局在を検証することで、TZがもつ拡散障壁またはゲートとしての機能を発揮するために必要な分子をそれぞれ特定することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
課題申請にあたり、当該年度の目標の一つとして挙げた超解像顕微鏡による繊毛形成過程でのTZの構築過程可視化することに成功した。加えて、当初は来年度に取り組む予定であった高吸水性ポリマーを用いて生物試料を3次元的に4倍大きくする方法 (膨張顕微鏡)の技術改変に着手し、タンパク質の架橋方法や膨張ゲル組成の改変により、これまでと比較してより等方的な試料膨張化を実現し、同時に目的分子の空間配置解析をより高輝度かつ高分解能で行なうことにも成功した。上記のイメージング法はSTEDやSTORMといった卓越した分解能をもつ超解像顕微鏡に匹敵する分解能を持ち、4つのレーザー光源を生かした複数分子の同時観察も可能である。本技術は光の回折限界がボトルネックとなり解析が困難であった小さな空間で機能を発揮する分子の空間配置を詳細に明らかにすることが可能であり、今後、繊毛に限らず様々な細胞内オルガネラの解析にとって有効な解析技術になることが期待できる。上記の項目に加え、本年度はゲノム編集技術を駆使してTZの構成分子や繊毛構築に関わる低分子量GTPaseのノックアウト細胞を多数構築し、これらを駆使してTZの構築を担う分子システムの一端を明らかにすることに成功した。さらに、TZの構成分子のKO細胞を用いて、繊毛の機能的区画化に資するTZ構成分子の機能の差異を発見し、課題趣旨であるTZ構成の異常と各種繊毛病の発症メカニズムの関係解明を達成に向けて当初の予想を上回る研究成果を得た。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度に得た成果をもとに、引き続き、哺乳類TZの構築を制御する分子システムの実体解明をめざす。また、繊毛膜タンパク質の一分子イメージングや光活性化型蛍光タンパク質を融合した繊毛膜タンパク質の観察システムを構築し、TZのKO細胞でみられる異常を詳しく明らかにする。また、TZの異常に資する繊毛病の発症メカニズムを明らかにすべく、TZのKO細胞に異なる繊毛病で見られる変異遺伝子を発現させ、これらの細胞株で見られる異常の詳細を明らかにする。
上記の項目に加えて、超々解像マルチカラーイメージングによって検出された未報告のTZ構成分子の局在について、この局在を生み出す分子的、エネルギー的要素の解析をすすめる。まずは、解析に必要となるKO細胞の構築、当該遺伝子産物をコードするレトロウィルス発現用プラスミドの作製を今年度前半に予定している。上記以外に、解析基盤となる膨張顕微鏡法の技術改変にも積極的に取り組んでいく。
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Report
(1 results)
Research Products
(8 results)
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[Journal Article] DOPAnization of tyrosine in α-synuclein by tyrosine hydroxylase leads to the formation of oligomers.2022
Author(s)
1.Jin M., Matsumoto S., Ayaki T., Yamakado H., Taguchi T., Togawa N., Konno A., Hirai H., Nakajima H., Komai S., Ishida R., Chiba S., Takahashi R., Takao T. and Hirotsune S.
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Journal Title
Nature Communications
Volume: 13(1):6880
Issue: 1
Pages: 6880-6880
DOI
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Peer Reviewed / Open Access
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