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ヒストンの受け渡し活性測定系の開発から探索するヒストンリサイクルの分子機構

Research Project

Project/Area Number 22K06210
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (C)

Allocation TypeMulti-year Fund
Section一般
Review Section Basic Section 44010:Cell biology-related
Research InstitutionSaitama Medical University

Principal Investigator

日詰 光治  埼玉医科大学, 医学部, 講師 (10378846)

Project Period (FY) 2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
KeywordsDNA複製 / ヌクレオソーム / クロマチン / ヒストン / 複製
Outline of Research at the Start

DNA複製に伴い、鋳型鎖DNAに結合していたヒストンを新生鎖に結合させて再利用する“ヒストンリサイクル”が行われる。これが正しく行われることで、複製前と同様の染色体が再構築される。ヒストンリサイクルにおいて、MCM2やDPB3-DPB4などのタンパク質が機能することが既に示されている。本研究ではヒストンリサイクルの反応を試験管内で再現し、その分子機構の解明を目指す。とりわけ、MCM2などのタンパク質が、①鋳型鎖から解離したヒストンと一時的に結合して保持し、②そのヒストンを新生鎖に受け渡す、という二つのステップを各々測定する実験系を開発し、そこで機能するタンパク質の活性を定量的に理解する。

Outline of Annual Research Achievements

精製したMcm2のN末領域(Mcm2N)とコアヒストン八量体との試験管内結合実験を進めたところ、八量体からH2A-H2B二量体が脱落したコアヒストン六量体とMcm2Nとが複合体を形成することを見出した。更に、この複合体にヒストンシャペロンFACTを加えると、結合する様子が検出された。一方で、FACTと同じくMcm2N、ヒストンと複合体を作ることが報告されているAsf1を添加しても、Mcm2N-ヒストン結合には影響せず、またAsf1がそこに相互作用することもなかった。
また、Mcm2Nは、保持したヒストン六量体をNap1存在下で解離させることもわかった。一方で、Mcm2N-ヒストン六量体複合体にDNAを加えると、凝集体を形成した。Mcm2N-ヒストン複合体にNap1を加えたうえで、DNAを添加すると、ヌクレオソームが形成される様子も検出した。
以上の結果から、ヒストンリサイクルのためにヒストンを保持したMcm2Nから、まずNap1などのシャペロンがヒストンを剥がし、そのうえでDNAにヒストンを供給してヌクレオソームを形成させるという、ヒストンの受け渡しのステップの存在が示唆された。
なお、DNA上にMcm2Nを固定してヒストンリサイクルを進めるために、SOS-boxを含むDNA上にLexA-Mcm2Nを固定した状態でコアヒストンを加える、あるいは、コアヒストンとLexA-Mcm2Nを混合したうえで、DNAを加えるなどの実験をしたが、いずれも混合した因子が凝集し、その先のヒストン受け渡し反応を進めるに至っていない。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

DNA上に固定したMcm2Nを利用してヒストンリサイクルを追跡するという当初の計画はうまくいかず、固定していないMcm2Nを用いて研究を進めている。しかし、その条件下において、各種ヒストンサイクル因子を添加する実験を行い、Mcm2N→Nap1というヒストンの授受が行われる様子が検出されている。当初の計画通りではないが、順調に解析結果は積み重ねられているため、おおむね順調に進展していると判断した。

Strategy for Future Research Activity

まず、引き続きDNA上に固定したMcm2Nでのヒストンリサイクルの系の確立を目指す。エキソヌクレアーゼを利用してDNA断片の一部だけを分解し、そこに形成させたヌクレオソームを解離させる系を確立して、そのヌクレオソームから遊離したヒストンをMcm2Nが保持できるかどうかの測定を行うことを目指すなど、系の確立とそれを用いた解析を実施する。
また、既に進めている遊離Mcm2Nを用いた解析も進める。Mcm2のN末領域はリン酸化修飾を細胞周期依存的に受けるので、それとヒストン結合や解離への影響を調べる。

Report

(2 results)
  • 2023 Research-status Report
  • 2022 Research-status Report
  • Research Products

    (1 results)

All 2023

All Presentation (1 results)

  • [Presentation] 出芽酵母Mcm2のN末端領域(Mcm2N)とヒストンとの結合・解離に関する生化学的解析:Mcm2Nは、ヒストンH2A-H2Bと競合的にヒストンH3-H4と相互作用し、Nap1存在下でヒストンと解離する2023

    • Author(s)
      日詰 光治
    • Organizer
      第46回日本分子生物学会年会
    • Related Report
      2023 Research-status Report

URL: 

Published: 2022-04-19   Modified: 2024-12-25  

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