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神経軸索性インポーチンによる細胞質ダイニン制御機構の解明

Research Project

Project/Area Number 22K06220
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (C)

Allocation TypeMulti-year Fund
Section一般
Review Section Basic Section 44010:Cell biology-related
Research InstitutionUniversity of Fukui

Principal Investigator

水野 克俊  福井大学, 学術研究院医学系部門, 助教 (00777774)

Project Period (FY) 2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Keywordsインポーチン / 神経軸索 / 細胞質ダイニン / ダイニン
Outline of Research at the Start

本研究では、インポーチン分子が神経細胞において核移行とは異なる機能、特に軸索輸送と細胞遊走について、分子モーターである細胞質ダイニン・キネシンとどのように関連しているかを解析する。手法としては、生化学的実験、顕微鏡によるイメージング実験、子宮内電気穿孔によるin vivoでの実験を組み合わせて実験を実施する。インポーチン分子におけるさまざまな変異が神経機能に及ぼす影響を検証することで、精神・神経疾患の病因の新たな分子機序の解明を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

神経細胞における細胞体から神経終末に至るまでの軸索輸送は記憶・学習・情動など高次脳機能において決定的な役割を果たす。インポーチンα (KPNA) やインポーチンβ(IPOβ)は代表的な古典的核移行因子であり、細胞質から核内への基質の輸送により様々なシグナルを核内へと伝える機能を持つ。近年、多様な精神疾患に核移行因子が関与することが報告されている。また、ストレス顆粒や凝集体の解消にインポーチンがシャペロンとして機能するなど、インポーチンが核移行以外の機能を有する多機能因子であることが明らかとなりつつある。本研究で代表者らは神経軸索中のKPNA1と分子モーターであるキネシンや細胞質ダイニン(以下ダイニンと呼称)との関係に着目し、核移行とは異なるインポーチンの神経軸索における機能の解析を目指した。
ラット、マウス神経生化学的解析の結果、神経軸索抽出物に多くの核移行関連因子が含まれていることが明らかとなった一方で、KPNAとIPOB1などの相互作用は、細胞質と軸索など神経突起では異なる可能性も示唆された。蛍光タンパク質との融合KPNA1やIPOB1を作成し、一次培養の神経細胞においてライブイメージングを行った。その結果、インポーチン分子が軸索で活発に輸送を受け、移動することが明らかとなった。一方で、インポーチン分子同士の相互作用は生化学的解析で示されたのと同様、細胞質では異なる可能性を支持した。同様の結果は、分子同士の近接性を評価するProximity Ligation Assayでも確認された。更に、疾患と関連する変異を有するKPNA1も検討したところ、特異的な局在を示すことができたことに加え、配列の改変によって改善させることができることが明らかとなった。以上の結果は核移行とは異なる軸索におけるインポーチンの機能と、疾患の原因を考える上で非常に重要な知見である。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

これまでの実験で、実験の実施に必要なマウス後根神経節細胞 (DRG)の一次培養および遺伝子導入の系、ならびにライブイメージングを行うための共焦点顕微鏡およびFRAP装置の準備が完了し、すでに実験を開始している。また、本年からインポーチン分子同士の相互作用を直接的に検証するためのProximity Ligation Assay (PLA)の実験系も導入し、確立している。観察の結果、KPNA1を含む多くのインポーチン分子が軸索を活発に輸送されている様子をイメージングすることができた。インポーチンαとインポーチンβ分子の同時観察、さらにダイニン中間鎖やダイナクチン構成因子などとの同時観察からも、動態や軸索での分子間相互作用についても知見が得られた。また、PLAの結果からも細胞質と軸索で異なる分子間相互作用が存在する可能性が示唆された。さらに、疾患と関連する変異をいれたKPNA1の解析を行った結果、異常な局在と動態を示すことが判明した。現在は、これらのデータの蓄積ならびにラットの大腿神経をモデルとした、免疫沈降/プルダウン実験とLC-MS/MSによる質量分析を含む生化学的解析を進めているところである。本研究成果に関する論文を執筆し、現在投稿中である。

Strategy for Future Research Activity

最終年度である今年は、論文の投稿と掲載を目的とする。そのための論文の執筆はすでに完了し、投稿中であるが、今後の発展性も見越して、さらに予備的な実験を複数計画する。
Proximity Ligation Assayの系をさらに発展させ、核内外でのKPNA1相互作用候補因子との近接性を評価する。加えて、分子間での相互作用を質量分析で解析するのに有効な、ビオチン近接標識による質量分析の解析を行う。そのために、近接ビオチン標識用のコンストラクトにKPNA1を連結する。KPNA1の多機能性から、細胞内の局在の違いが重要となる。核内にKPNA1は集積することが知られるが、軸索局在性のKPNA1の分子複合体を解析するには、核内KPNA1からの持ち込みを排除する必要がある。そこで、核外移行配列を付加した近接標識コンストラクトを作成し、コントロールと比較することで軸索特異的なKPNA1分子複合体を詳細に解析する。以上の実験を加えることで、神経細胞軸索局在性のKPNA1の分子生物学的意義をより詳細に明らかにしていきたい。

Report

(2 results)
  • 2023 Research-status Report
  • 2022 Research-status Report
  • Research Products

    (12 results)

All 2023 2022

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results,  Open Access: 1 results) Presentation (10 results) (of which Invited: 1 results)

  • [Journal Article] Immotile cilia mechanically sense the direction of fluid flow for left-right determination2023

    • Author(s)
      Katoh Takanobu A.、Omori Toshihiro、Mizuno Katsutoshi、Sai Xiaorei、Minegishi Katsura、Ikawa Yayoi、Nishimura Hiromi、Itabashi Takeshi、Kajikawa Eriko、Hiver Sylvain、Iwane Atsuko H.、Ishikawa Takuji、Okada Yasushi、Nishizaka Takayuki、Hamada Hiroshi
    • Journal Title

      Science

      Volume: 379 Issue: 6627 Pages: 66-71

    • DOI

      10.1126/science.abq8148

    • Related Report
      2022 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Planar cell polarity?dependent asymmetric organization of microtubules for polarized positioning of the basal body in node cells2022

    • Author(s)
      Sai Xiaorei、Ikawa Yayoi、Nishimura Hiromi、Mizuno Katsutoshi、Kajikawa Eriko、Katoh Takanobu A.、Kimura Toshiya、Shiratori Hidetaka、Takaoka Katsuyoshi、Hamada Hiroshi、Minegishi Katsura
    • Journal Title

      Development

      Volume: - Issue: 9 Pages: 200315-200315

    • DOI

      10.1242/dev.200315

    • Related Report
      2022 Research-status Report
    • Peer Reviewed
  • [Presentation] A novel neuronal function of mouse KPNA1/importin alpha 5 in axonal transport2023

    • Author(s)
      Katsutoshi Mizuno, Masaki Sugahara, Ryota Kato, Hirotaka Nomiya, Takafumi Itoh, Satoshi Fujita, Masami Yamada
    • Organizer
      第75回日本細胞生物学会年会
    • Related Report
      2023 Research-status Report
  • [Presentation] 神経軸索輸送における核移行因子KPNA1の新規機能2023

    • Author(s)
      水野克俊, 菅原将樹, 加藤諒大, 野宮廣貴, 伊藤貴文, 藤田聡, 山田雅己
    • Organizer
      第46回日本分子生物学会年会
    • Related Report
      2023 Research-status Report
  • [Presentation] 神経細胞における軸索性インポーチンの新規機能解析2023

    • Author(s)
      水野克俊, 菅原将樹, 加藤諒大, 野宮廣貴, 伊藤貴文, 藤田聡, 山田雅己
    • Organizer
      第19回福井大学ライフサイエンスイノベーションセンター研究交流会
    • Related Report
      2023 Research-status Report
    • Invited
  • [Presentation] Importin alpha 1/KPNA1は神経細胞遊走を制御する2022

    • Author(s)
      加藤諒大、水野克俊、菅原将樹、野宮廣貴、藤田聡、山田雅己
    • Organizer
      日本生化学会北陸支部会第40回大会
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      2022 Research-status Report
  • [Presentation] KPNAN1/インポーチンα1のマウス神経軸索輸送・神経遊走における新規機能2022

    • Author(s)
      水野克俊、菅原将樹、加藤諒大、野宮廣貴、宮本洋一、岡正啓、疋田貴俊、伊藤貴文、藤田聡、山田雅己
    • Organizer
      第74回日本細胞生物学会大会
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  • [Presentation] 神経細胞遊走活性を指標としたKPNA1/Importin α1の新規機能の解明2022

    • Author(s)
      加藤諒大、水野克俊、菅原将樹、野宮廣貴、宮本洋一、岡正啓、疋田貴俊、伊藤貴文、藤田聡、山田雅己
    • Organizer
      第74回日本細胞生物学会大会
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  • [Presentation] 軸索輸送におけるKPNA1複合体関連因子の同定と機能解析2022

    • Author(s)
      菅原将樹、水野克俊、加藤諒大、野宮廣貴、宮本洋一、岡正啓、疋田貴俊、伊藤貴文、藤田聡、山田雅己
    • Organizer
      第74回日本細胞生物学会大会
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  • [Presentation] 膠芽腫細胞の遊走に対するImportin α1の役割に関する研究2022

    • Author(s)
      山内貴寛、野宮廣貴、水野克俊、菊田健一郎、山田雅己
    • Organizer
      第22回日本分子脳神経外科学会
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  • [Presentation] マウスノード不動繊毛は変形の向きを感知して左右軸を決定する: 非対称性を生み出すメカニカルな機構2022

    • Author(s)
      加藤孝信、大森俊宏、水野克俊、石橋岳志、岩根敦子、石川拓司、岡田康志、西坂崇之、濱田博司
    • Organizer
      第60回日本生物物理学会年会
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  • [Presentation] マウスノード不動繊毛は変形の向きを感知して左右軸を決定する: 非対称性を生み出すメカニカルな機 構2022

    • Author(s)
      加藤孝信、大森俊宏、水野克俊、石川拓司、濱田博司
    • Organizer
      第74回日本細胞生物学会大会
    • Related Report
      2022 Research-status Report

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Published: 2022-04-19   Modified: 2024-12-25  

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