Functional roles of Klf-typed transcription factors in cardiovascular system

• Project/Area Number: 22K06235
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 44020:Developmental biology-related
• Research Institution: University of Yamanashi
• Principal Investigator: 川原 敦雄 山梨大学, 大学院総合研究部, 教授 (10362518)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
• Keywords: ゲノム編集技術 / Klf型転写因子 / ゼブラフィッシュ / 循環器システム / 造血発生 / 機能欠損変異体 / 循環器系

Outline of Research at the Start

心臓・血管発生と連動する循環器系の構築は個体発生で最初に機能する器官であり心疾患を含む循環器疾患は日本人の死因の上位を占めることから、循環器系を調節する分子の同定とその分子機能の解明は、循環器系の生理機能および循環器疾患の病態の理解に必要不可欠である。研究代表者が単離したKlf型転写因子であるklf17遺伝子を破壊したklf17遺伝子破壊ゼブラフィッシュは、心臓の肥大が認められ、さらに、klf17-klf1二重変異体では一次造血における赤血球循環の不全が観察された。これらの機能欠損変異体の表現型解析およびKlf型転写因子の分子機能解析からKlf型転写因子の循環器系における新規機能を解明する。

Outline of Annual Research Achievements

研究代表者は、新規のKlf型転写因子であるklf17遺伝子を世界に先駆け同定しており、これまで形態形成におけるKlf17分子の生理機能の解明に取り組んできた。Klf型転写因子(Klf1-Klf17)はC末にDNA結合ドメイン（Znフィンガー）を保有する巨大な分子ファミリーであり、標的遺伝子の発現誘導を介して様々な器官形成を制御していると考えられているが、それらの分子機能の全貌解明には至っていない。研究代表者は、ゼブラフィッシュの初期発生過程においてklf17遺伝子がklf1遺伝子と同様に造血発生の場である血島に強く発現が誘導されることを報告しており、また、生育過程におけるklf17遺伝子の発現動態を調べた結果、稚魚の心臓においてklf17遺伝子が発現していることを見出した。これらの結果はKlf17分子が造血発生や心臓形成に重要な転写因子である可能性を示唆しており、さらに、複数のKlf型転写因子が発現している血島ではKlf型転写因子同士が機能的に相互作用している可能性が考えられた。本研究では、ゲノム編集技術であるCRISPR-Cas9法を用いたゲノム改変を基盤としてklf1遺伝子破壊ゼブラフィッシュおよびklf17遺伝子破壊ゼブラフィッシュを作製し、それらの造血発生および心臓形成における表現型解析からKlf型転写因子の循環器システムにおける新規の生理機能を明らかにする。klf1単独変異体およびklf17単独変異体は造血発生に顕著な異常が認められないが、klf1-klf17二重変異体では赤血球の減少が認められた。さらに、klf1変異体は心臓形成に異常は認められないが、klf17変異体は生育過程で心臓が肥大する形態異常が認められている。本研究では、Klf型転写因子の機能欠損変異体のin vivo解析から造血・循環系における役割を明らかにする。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究は、ゲノム編集技術CRISPR-Cas9法で作製されたklf1遺伝子破壊ゼブラフィッシュおよびklf17遺伝子破壊ゼブラフィッシュの表現型解析から造血発生および心臓形成におけるKlf型転写因子の生理機能の解明を目指している。本年度は、Klf型転写因子の造血発生における生理機能を解析した。klf1遺伝子およびklf17遺伝子はともに造血発生の場である血島に強く発現しているが、klf1変異体およびklf17変異体は初期発生において顕著な造血発生の異常は示さなかった。これに対して、klf1-klf17二重変異体は、2日胚で循環する赤血球の数が減少し、それと相関してヘモグロビンの合成量も抑制されていることが明らかとなった。これに対して、ミエロイド系細胞の産生は上記の二重変異体と野生型で差がなく赤血球の発生に特異的に異常を示していた。赤血球は分化・成熟する過程で核の細胞質に対する割合が減少することが知られているが、klf1-klf17二重変異体は野生型と比較して核の割合が高い状態で維持されており、形態学的に赤血球の分化・成熟過程に不全を伴っている可能性が示唆された。klf1-klf17二重変異体において、赤血球における様々な分化マーカー遺伝子の発現動態を解析した結果、sclおよびc-mybなどの赤血球幹細胞マーカーは野生型と同様に発現が誘導されていたが、一部のヘム合成酵素遺伝子（alas2など）および赤血球の分化マーカー遺伝子であるband3およびmitoferrinの発現が減少していることが明らかになった。これらの結果は、Klf1分子とKlf17分子が協調して赤血球の分化を制御していることを示している。

Strategy for Future Research Activity

本研究の目的は、Klf型転写因子の造血発生および心臓形成における生理機能の解明である。klf1単独変異体およびklf17単独変異体では造血発生に異常は認められないが、klf1-klf17二重変異体において赤血球が減少するといった造血発生における異常が認められた。実際に採取した赤血球の形態学的な解析からは赤血球の分化異常を伴っていることが示唆された。今後は、赤血球を赤色蛍光タンパク質(mRFP)で可視化したトランスジェニック系統を用い赤血球の分化に必須である微小環境（ニッチ）から循環器系に移出するプロセスを共焦点顕微鏡でリアルタイムに解析し、赤血球の分化異常がどのように循環する赤血球の減少に繋がるのかを明らかにする。また、野生型とklf1-klf17二重変異体を用いた発現動態解析からは赤血球幹細胞マーカーの発現に差はないが、一部のヘム合成酵素と赤血球分化マーカーの発現が減少している結果を得ている。今後は、これらの候補遺伝子の発現変動を定量PCR法などによる定量的な解析で検証する。さらに、Klf1転写因子およびKlf17転写因子がこれら候補遺伝子の発現誘導をどのように協調して制御しているかを調べる。
klf1変異体およびklf17変異体を用いKlf型転写因子の心臓形成における役割を調べる。野生型およびklf1変異体は心臓の形態と機能などに顕著な異常は認められないが、klf17変異体は約40日齢までに心臓の肥大といった形態異常が認められた。今後は、野生型とklf17変異体から心臓の組織切片を作製し組織学的な解析を行う。さらに、野生型とklf17変異体の心臓からtotal RNAを調整し、RNA sequence解析を行うことでKlf17転写因子の心臓における標的遺伝子を同定し、それら候補遺伝子の心臓形成における役割を明らかにする。