Analysis of regulatory mechanisms of stemness in human pluripotent stem cells

Research Project

Project/Area Number	22K06237
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 44020:Developmental biology-related
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	樽本雄介京都大学, 医生物学研究所, 助教 (70551381)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2024: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000) Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2022: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Keywords	ヒト多能性幹細胞 / 遺伝子発現制御 / 未分化性 / 多能性幹細胞 / 遺伝子発現 / CRISPRスクリーニング
Outline of Research at the Start	ヒト多能性幹細胞の未分化性（多能性）を制御する分子基盤は不明な部分が多く、この細胞を利用する基礎研究や臨床応用の発展において支障となっている。本研究では、未分化性の維持に重要な転写調節因子であるPRDM14と、独自のスクリーニングによって新たに同定した転写調節補因子の機能解析を中心におこない、これら転写調節因子がどのようにヒト多能性幹細胞の未分化性を制御しているかその分子機構を明らかにすることを目指す。本研究から得られる知見は、均一な性質をもつヒト多能性幹細胞の培養や安定な着床前胚を模倣するヒト多能性幹細胞の樹立など、この細胞の有用性をより高めることへとつながることが期待される。
Outline of Annual Research Achievements	これまでにヒト多能性幹細胞の未分化性の維持に重要な転写調節因子Xを新たに同定し、未分化維持に重要な既知の転写因子であるPRDM14の機能的パートナーとしての役割をもつことを見出している。本研究ではより詳細な解析をおこなうため、まずヒトiPS細胞において、因子XあるいはPRDM14の改良型AID(Auxin-inducible degron)システムによる誘導分解系を組み込んだ細胞株をそれぞれ樹立した。誘導分解して6時間後の両者のクロマチン結合をChIP-qPCRで調べたところ、PRDM14分解時には因子Xのクロマチン結合がほぼ失われるのに対して、因子X分解時にはPRDM14の結合量は半分程度になっていた。これらの結果は、因子Xの結合がPRDM14に完全に依存していること、因子XがPRDM14の結合の安定化に重要であることを示唆しており、これまで因子XあるいはPRDM14のノックアウト細胞でみられた表現型の違い（発現が変化する遺伝子数や未分化マーカーの発現低下の時間）を説明すると考えられる。マウスES細胞では、因子XではなくそのホモログYがPRDM14の機能的パートナーであると報告されており、ヒトiPS細胞とは異なる。因子XとホモログYの機能の違いを検討するため、ホモログYを過剰発現したヒトiPS細胞で因子Xを誘導分解した。その結果、因子Xの欠損で引き起こされる遺伝子発現の変化が抑制され、未分化性の喪失も起こらなくなったことから、この実験系ではホモログYが因子Xの機能を代替可能であり、両者の機能的差異は検出されなかった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason プライム型ヒト多能性幹細胞をナイーブ型へと変換する方法を改善するために検討を重ねており、ナイーブ型細胞を用いた研究がやや遅れている。プライム型細胞を用いた研究は順調に進んでいる。
Strategy for Future Research Activity	ナイーブ型ヒト多能性幹細胞への変換を安定的におこなえるようにし、遺伝学的、生化学的、エピジェネティックな解析手法を組み合わせてプライム型とナイーブ型ヒト多能性幹細胞それぞれでのPRDM14、因子X、ホモログYの機能を遺伝子発現制御の観点から検討していく。