| Project/Area Number |
22K06239
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 44020:Developmental biology-related
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
中島 圭介 広島大学, 両生類研究センター, 助教 (60260311)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田澤 一朗 広島大学, 両生類研究センター, 助教 (10304388)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
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| Keywords | 生体観察 / 黒色色素 / 虹色色素 / 黄色色素 / ネッタイツメガエル / ノックアウト / ゲノム編集 / 骨染色 / 脊索 / 硬骨 / 生体染色 / 受容体 / 変態 / 尾部退縮 / カルセイン / アリザリンレッド / olfm4 / scppa2 / thyroid hormone / receptor / metamorphosis |
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| Outline of Research at the Start |
変態現象は殆どの動物門において観察され、極めて普遍性の高い生存戦略である。甲状腺ホルモンによる無尾両生類の変態において、急激な尾部退縮は劇的であり、筋細胞死はアポトーシスの典型例である。しかし、甲状腺ホルモン受容体βノックアウトカエルの尾では、筋細胞死が起きているにも関わらず、尾部の退縮と脊索の崩壊が顕著に抑制された。この結果は、急激な尾部の退縮には脊索の崩壊が必須であることを示唆する。本研究は、「脊索の崩壊が急激な尾の退縮の本質的な要因である」という新たな発想に基づき、マイクロCT を用いた形態学的解析とノックアウト技術を組み合わせ、尾部退縮における脊索崩壊の役割と分子機構を明らかとする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
2023 年度は査読付き国際学術雑誌に二つの論文発表を行なった。これらの業績のうち、下記の業績が本研究課題と関係するものである。両生類は黒色素胞・虹色素胞・黄色素胞という３種類の色素細胞を持つ。課題責任者はこれまでに、これら３種類各々の色素を持たなくなるノックアウトガエルの作成を報告している (Development Growth & Differentiation 2012, Developmental Biology 2017, Developmental Dynamics 2021)。この研究はこれら３種類のノックアウトガエルを交配し、全ての色素を持たないカエルを作出したものである。このカエルは色素を持たないために、生きたまま脊索など体内の観察が容易である。本研究課題の主題である脊索崩壊に関わると考えられる olfm4 遺伝子のプロモータに GFP を融合させ、このカエルを用いてトランスジェニックカエルを作成すれば、olfm4 遺伝子の発現パターンを生きたまま観察可能になると考えられる。現在、変態期に GFP の発現を上昇させることができるプロモーター領域のクローニングに成功しており、このプロモータ領域を用いたトランスジェニックを行い、幼生を飼育中である。
Keisuke Nakajima*, Ichiro Tazawa, Nobuaki Furuno*
Generation of translucent Xenopus tropicalis through triple knockout of pigmentation genes
Development, Growth & Differentiation 2023; 65 (9): 591-598
Impact Factor-2021: 3.063
DOI: https://doi.org/10.1111/dgd.12891
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題「脊索崩壊に着目した両生類変態における尾部退縮機構の解析」は、いつ（急激な尾部退縮と脊索崩壊のタイミング）・どこで（脊索崩壊は体幹部と尾部で同時に起こるのだろうか？）・どのように（脊索崩壊の分子機構の解明）脊索崩壊が起こっているのかを明らかとすることを目的としている。当初は Micro CT による脊索観察を考えていたが、この方法は観察自体がうまく進まず、しばらく頓挫していた。しかし、昨年度末に広島大学霞キャンパスに新たな Micro CT (CosmoScan GXIII) が導入されたため、今後はこの機械を使って観察を試みる予定である。既に講習会に参加し、使用方法は習得した。また、in situ hybridization (ISHCR) を用いて発現部位や時期を同定する予定であったが、発現量が低い時期や部位において遺伝子の検出がうまくできない場合があった。しかし、2023年度に in situ hybridization chain reaction という新しい技術を取り入れ、これまで検出できなかった遺伝子を検出できるようになった。この技術は1分子の mRNA を検出することが可能であり、さらに定量的解析も可能であるため、本研究において極めて重要なものとなると考えられる。今後はこの新たな機械 (CosmoScan GXIII) や技術 (ISHCR) を用いて目的の遂行を進めていく予定である。研究実績の項目でも触れたが、本研究課題において注目している olfm4 遺伝子のプロモーター領域のクローニングに成功しており、色素を持たないトリプルノックアウトガエルを作成し、これを用いたトランスジェニックカエルの作成も始めている。プロモーター領域の解析には尾の退縮を待たなければならないという事情があり、大変長い時間を必要とする点が課題である。
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| Strategy for Future Research Activity |
mmp9-th, scppa2, mmp13, olfm4 遺伝子の発現量を RT-PCR を用いて測定したところ、予想に反してノックアウトガエルの mmp9-th, scppa2, mmp13 遺伝子の発現量は野生型と同等以上であった。この結果は、ノックアウトガエルの脊索において甲状腺ホルモン受容体α (TRa) が補償的に働いた結果である可能性が高い。そうであるならば、4つの遺伝子は全て、同じ組織において発現していることから、olfm4 遺伝子の発現だけは受容体β (TRb) によってのみ誘導されると考えられる。従来、TRa と TRb には、機能的に差はないと考えられてきたため、衝撃的な示唆である。二つの受容体の機能的な差を明らかとするために、olfm4プロモーター領域を明らかとする必要があるが、プロモーター解析を行うためにはトランスジェニックを行った幼生を変態させなければならず、このためには数ヶ月の時間を要する。この問題を解決するために、現在、受精後２週間の幼生を甲状腺ホルモン処理することにより、変態期の遺伝子発現パターンを再現させる実験系を開発中である。トランスジーンの発現量の定量化及び、甲状腺ホルモン処理による実験系の開発は成功の目処が立っており、現在、再現性などの確認を行なっている。また、上記のように TRa が TRb の機能を補償しているという仮説が成り立つためには、二つの遺伝子が olfm4 発現細胞において共発現していることが前提となる。この二つの遺伝子は発現量が低いために、従来の in situ hybridization では検出することが困難であった。新たに導入した in situ hybridization chain reaction を用いることにより、TRa と TRb の二つの遺伝子が共発現していることを示す予定である。
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