| Project/Area Number |
22K06246
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 44020:Developmental biology-related
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
廣川 信隆 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 名誉教授 (20010085)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥390,000 (Direct Cost: ¥300,000、Indirect Cost: ¥90,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
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| Keywords | 左右決定機構 / ノード流 / ポリシスチン / 細胞外小胞 / 神経可塑性 / 左右軸決定 / ノード流 |
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| Outline of Research at the Start |
体の左右軸決定の機構は胎生初期 node の単線毛 の回転により発生する胎児外液の左向きノード流が基盤的役割を担うが、 その後のnode 左側でのCa ++濃度上昇へ繋ぐ機構は不明であり、ノード流による線毛の傾きを物理的に感知するmechano-sensor 仮説とノード細胞から分泌され左へ流される形態形成因子を感知するchemo-sensor 仮説の2つがある。本研究では、 光蛍光転移 KiKGR - Pkd1L1マウスを作製しPKD1L1がノード流により左 へ移送され、PKD1L1/PKD2 ポリシスチン複合体がNodal を感知し左優位なCa ＋＋濃度上昇をchemo-sensor として惹起するかを研究する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
体の左右軸決定の分子機構は、発生生物学の重要課題である。胎生初期ventral node の単線毛の回転により胎児外液の左向きノード流が発生しこれが基盤的役割を担う事が示されたが、その後に起こるventral node 左側でのCa ++イオン濃度上昇を繋ぐ分子機構は不明であり、PKD1/PKD2 複合体が、ノード流によってもたらされるNode 線毛の傾きを物理的に感知するmechano-sensor として働くというmechano-sensor 仮説とノード細胞から分泌されるmorphogen が左に流されそれを感知するchemo-sensor として働くという2つの仮説がある。本研究では、photoconvertible KiKGR - Pkd1L1マウスを作製し、ventral node でPKD1L1がノード流により左側へ移送され、左優位の局在を示し、PKD1L1/PKD2 ポリシスチン複合体がNodal をリガンドとして感知し左優位なCa ++イオン濃度上昇をchemo-sensor として惹起し、morphogen 仮説を検証した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
PKD１L1の動態解析の為に、CRISPR/Cas9 法により光蛍光転移KiKGR tag でマウスPkd1L1 遺伝子N-末を標識し、光蛍光転移 を用いてventral node でのPKD1L1の動態、左への移送及び左優位の局在の有無を検討した。
1）私達は、まずPKD1L1 とNodal の免疫細胞化学を行いventral node でPKD1L1 蛋白が左のendoderm crown cells(ECCs)に強く局在し、一方Nodal 蛋白は、左右両側に局在する結果を得た。次にPKD1L1 と Nodal の局在をwhole mount proximity ligation assay を用いて解析しventral node の左側で優位に共局在のシグナルが検出された。更に左のcrown cells により取り込まれ内在化されたPKD1L1 がポリシスチン活性を上昇させNodal により誘引される長く持続するCa ++イオン濃度上昇を誘引する結果を得た。
2）CRISPR/Cas9 法により光蛍光転移KikGR cDNA をC57BL/6 マウスPKD1L1 遺伝子start codon の前にknock inし、photoconvertible fluorescence の緑から赤への蛍光転移によりin vivo でPKD1L1蛋白の動態を追跡することが出来た。点状の蛍光シグナルが2-somite stage の胎児の左半分（左NCCを含む）に優位に局在した。
更に蛍光転移実験により、シグナルが左に移送され、PKD1L1 蛋白が、nodal pit cells(NPCs)で翻訳後ノード流で左に移送されることが示され、今まで未知であった左向きノード流と左優位なCa ++イオン濃度上昇を繋ぐ最も重要なFGFR 依存性の分子機構であることを示すことが出来た。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究は当初の計画以上に進展している。今後は、FGFR 情報依存性にnodal pit cells(NPCs)から放出される細胞外小胞の生化学・免疫細胞化学的解析により他の重要な蛋白質の解析を行う。
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