血流循環型細胞のサイズ制御機構

• Project/Area Number: 22K06252
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 44020:Developmental biology-related
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 佐藤 有紀 九州大学, 医学研究院, 准教授 (90508186)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2024: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000); Fiscal Year 2023: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000); Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
• Keywords: 内皮－造血転換 / 細胞サイズ制御 / アクアポリン / 浸透圧

Outline of Research at the Start

骨髄造血を担う造血幹細胞は、胚発生期に血管内皮細胞が分化転換することにより生み出される。内皮－造血転換の際、扁平・付着性の血管内皮細胞から球形・遊離性の造血幹細胞への急激な形態変化がおこる。さらにこの過程で細胞サイズ（体積と表面積）が４分の1以下まで縮小する。細胞の縮小は、血流循環型の細胞拡散に必須のしくみと考えられるが、その分子メカニズムは全く不明である。内皮－造血転換後に血管内腔へ遊離した造血幹細胞は、血流循環により肝臓内へ運搬されて一時的に貯留されたのち、さらに血流に乗って骨髄へ移動する。このような造血幹細胞に特有の広域移動現象の意義を本研究を通じて理解したい。

Outline of Annual Research Achievements

骨髄造血を担う造血幹細胞は、胚発生期に血管内皮細胞が分化転換することにより生み出される。これを「内皮－造血転換」と呼ぶ。内皮－造血転換の際、扁平・付着性の血管内皮細胞から球形・遊離性の造血幹細胞への急激な形態変化がおこる。さらにこの過程で細胞サイズが４分の1以下まで縮小する。細胞の縮小は、血流循環型の細胞拡散に必須のしくみと考えられるが、その分子メカニズムは全く不明である。申請者らが実施した造血性血管内皮細胞のRNA-seq解析から、水チャネルAQP1を高レベルで発現している細胞において、電解質イオンの輸送に関わる膜チャネルおよびトランスポーター遺伝子群が発現上昇することが判明している。これらの分子群が協調して浸透圧調整を行い、細胞サイズを制御する可能性が高い。本研究ではこれらの候補分子群のうち、カルシウム依存性クロライドチャネルANO1に着目し、以下の解析を進めた。本年度に実施した発現解析から、ウズラ胚（in vivo）においてANO1は造血性血管内皮細胞群の膜表面に局在すること、さらにin vitro内皮－造血転換モデルにおいても同様にANO1が造血性血管内皮細胞群の膜表面に局在することを確認した。また、CRISPR/Cas9ゲノム編集法を用いてANO1遺伝子のノックアウト解析（電気穿孔法による組織特異的欠失変異導入）を実施した。その結果、ANO1をノックアウトした造血性血管内皮細胞では正常に球状化が起こらなかった。in vitro内皮－造血転換モデルを用いてANO1ノックアウト細胞のサイズを計測したところ、コントロール細胞と比較して細胞体積および表面積に関して顕著な変化を示さなかった。これらの結果から、ANO1は内皮－造血転換の際の細胞球状化に必須であるが、細胞サイズの制御には関わらない可能性が示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

in vivoおよびin vitroモデルの両方を用いてANO1の発現解析、ノックアウト解析を実施することができた。当初の予測に反して細胞サイズ制御へのANO1の関与を示唆する結果は得られなかったが、内皮－造血転換現象に必須の分子である可能性は示唆されたので、研究の進捗としてはおおむね順調である。

Strategy for Future Research Activity

内皮－造血転換中の細胞群において発現上昇するカルシウムチャネル TRPC3, TRPC6, TRPM8、カリウム－クロライド共輸送体 SLC12AについてもCRISPR/Cas9ゲノム編集法を利用したノックアウト解析を実施し、細胞球状化の有無、液胞形成の有無、細胞・液胞サイズ、造血幹細胞への転換の有無について調べる。