| Project/Area Number |
22K06286
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 44030:Plant molecular biology and physiology-related
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| Research Institution | Rikkyo University |
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Principal Investigator |
堀口 吾朗 立教大学, 理学部, 教授 (70342847)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
古賀 皓之 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 助教 (30783865)
前川 修吾 専修大学, 商学部, 講師 (80711209)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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| Keywords | シロイヌナズナ / プラスチド / リボソーム / リボソームストレス応答 / NAC型転写因子 / RFC3 / SPRT1 / SZK1 |
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| Outline of Research at the Start |
リボソームはタンパク質とRNAかならなる複合体で、その生合成の異常はプロテオームを撹乱し、生物の生存に悪影響を及ぼす。植物は真核型、プラスチド型、ミトコンドリア型のリボソームを持つがそれぞれのリボソームの生合成異常に応答する仕組みは真核型において一部明らかになっているだけである。本研究では、シロイヌナズナを用いてプラスチド型、真核型リボソームストレス応答機構の共通性と特異性を明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、真核型リボソーム、プラスチドリボソームに対応するストレス応答をそれぞれeukaryotic ribosome stress response (e-RSR), plastid RSR (p-RSR)と呼び、p-RSRについて焦点を当てている。令和5年度は4年度に実施したp-RSRを示すシロイヌナズナrfc3の抑圧変異株 (sprtと総称する)のNGS解析から見出された候補遺伝子について解析を進めた。まず、今回候補として見出された遺伝子は全てプラスチド局在タンパク質をコードするものであった。rfc3背景で候補遺伝子のそれらの遺伝子破壊を行い、p-RSRの抑圧能の有無を解析した。その結果、レトログレードシグナル伝達に関わるGUN1, プラスチド内RNA代謝（スプライシング、RNA分解、rRNAプロセシング）関連因子、プラスチド内タンパク質分解関連因子が見出された。従って、プラスチド内のタンパク質安定性やRNA代謝のバランスによって、p-RSRの誘導の有無が制御されるものと考えられる。
一方、既知のe-RSR因子をrfc3と交配し、その表現型が抑圧されるかを解析したところ、NAC型転写因子をコードするSZK1, SZK3, SZK4の関与が示唆された。従って、e-RSRとp-RSRは転写応答の仕組みを共有していると考えられる。
さらに、p-RSR関連因子を見出すため、rfc3 sprt1を親株とした抑圧変異株（rfc3に類似した表現型に戻る）のスクリーニングを行った。ここでは、主根の短縮、側根の形成異常を指標に一次スクリーニングを行い、次いで、表現型の再現性の確認と、rfc3に類似した表現型の有無（幹細胞を欠く瘤状側根の形成や葉が尖る表現型）の解析を行った。現時点で100系統以上の変異株が得られ、その中からさらにp-RSRに関連する可能性が高いものを選抜する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
rfc3 sprtの候補遺伝子の探索と同定はほぼ順調に進んでいる。これまでに同定された遺伝子はその全てがプラスチド局在タンパク質をコードしていた。引き続きNGS解析を進めることで、プラスチド以外で働くp-RSR関連因子も含め、この現象に関わる遺伝子の全体像を掴むようにしたい。
これまでに、e-RSRとp-RSRはSZK1, 3, 4といったNAC型転写因子を通じて転写御応答を行うことが明らかになった。e-RSR因子については、これらの因子と並列、あるいはそれらの上流で働くもの見出している。これらには、SZK1, 3, 4とは異なるNAC型転写因子、ヒストン修飾関連因子、ユビキチンリガーゼ、真核型リボソームタンパク質、WD40リピートタンパク質などが含まれ、それらの変異株とrfc3との2重変異株を作成した。
SPRT1に関しては解析が難航している。SPRT1-GFPはrfc3 sprt1の相補能はあるものの、植物細胞内での蓄積量が非常に低いことが示唆された。SPRT1-GFP遺伝子を35Sプロモーターで発現させる代わりに、増殖活性が高い組織で強くい活性を持つRPL4Dプロモーターに置き換えたが、同様の結果であった。一方、p-RSRが生じている組織をpSZK1::GFP/rfc3 szk1において観察したところ、根端分裂組織や側根原基で強いGFP蛍光が観察された。現在、pSZK1::GFP/szk1系統を用いて、主根のオーキシン処理とともにカナマイシンなどの翻訳阻害剤処理を行うことで、p-RSRを示す細胞が豊富に含まれなおかつ、pRSRが同調的に誘導される実験系を確立中である。最終年度に向けてこれまでに得られた変異株の解析を進める準備が整いつつある。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和6年度は本研究の最終年度にあたるため、研究の取りまとめを進める。まず、rfc3 sprtのNGS解析から変異同定まではルーチンに進んでいる。変異同定をさらに進めることで、p-RSR関連遺伝子群の全体像を把握する。このようにrfc3 sprtの原因遺伝子の特定が進んだことで、異なる性質を持つ変異株を選んで解析することが可能となった。これらを用いてプラスチドrRNAのプロセシングの動態とSZK1誘導との相関を明らかにすることで、プラスチド内のp-RSR経路を区分しその相互関係を明らかにする。その際、rfc3によるプラスチドrRNAの減少は回復しないが、SZK1の発現上昇は抑制されるsprt変異は、p-RSRの情報伝達において非常に重要だと考えられる。
一方、抗生物質を用いたp-RSRの誘導系も確立しつつある。野生型でp-RSRを誘導すると、プラスチドrRNAプロセシング異常とプラスチドリボソームの翻訳阻害のいずれがp-RSRに重要なのかを判断できると考えられる。また、rfc3 sprtに適用するとp-RSRにこれらのSPRTタンパク質が関与するのか、あるいはプラスチドrRNAやプラスチドリボソームの制御に関わるだけなのかが推定できると考えられる。
また、SPRT1-GFPがプラスチドリボソームストレス下で豊富に存在する条件の探索を引き続き進める。条件が整えば、MS解析、RNA免疫沈降解析を進める。
最後に、e-RSRとp-RSRとの関連については、解析のための２重変異株が揃ったため、rfc3の表現型の抑制能を指標に両経路の合流点を明らかにする。
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