| Project/Area Number |
22K06288
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 44030:Plant molecular biology and physiology-related
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| Research Institution | Kwansei Gakuin University |
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Principal Investigator |
武田 直也 関西学院大学, 生命環境学部, 教授 (60571081)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
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| Keywords | 根粒共生 / 植物微生物間相互作用 / カルシウムシグナリング / 菌根共生 |
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| Outline of Research at the Start |
植物はアーバスキュラー菌根菌や根粒菌との共生の成立過程では、共生シグナル分子の受容による宿主‐共生菌間の相互認識が行われる。この共生シグナル伝達において「カルシウム振動」は、共生シグナル分子の受容によって細胞内Caイオン濃度の周期的な変動を示す共生応答反応である。本研究では、カルシウム振動の起動に関わる共生シグナル分子の受容体とその共生応答反応を解析する。さらに生体内でCaイオンのオシレーションを人工的な再現し、下流の共生応答の発生を検出する。これらの解析から、セカンドメッセンジャーとして広い役割を持つCa2イオンが、振動現象によってコードする共生シグナル情報を解読する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
アーバスキュラー菌根（AM）菌や根粒菌と植物との相利共生は、植物の生存と環境適応に大きな利益をもたらしている。これらの共生の成立過程では、双方の生物から共生シグナル分子が分泌され、それらの受容により宿主‐共生菌間の相互認識が行われる。AM・根粒両共生シグナル伝達において宿主植物にみられる「カルシウム振動」は、共生シグナル分子の受容によって細胞内Ca2+濃度の周期的な変動を示す共生応答反応である。その特徴的な振動パターンが共生シグナル情報をコードすると考えられるが、その機能はいまだ不明である。本研究では、カルシウム振動の起動に関わる共生シグナル分子の受容体の探索とその受容体変異体の解析を行う。さらに生体内で人工的にCa2+のオシレーションを生じさせることでカルシウム振動を再現し、下流の共生応答の発生を確認する。これらの解析から、セカンドメッセンジャーとして広い役割を持つCa2+が振動現象によってコードする共生シグナル情報を解読する。
2023年度は、昨年度に引き続き、本研究で同定したカルシウム振動の起動能を失ったキチン受容体LYS6のAM共生における機能を、lys6変異体の解析などから明らかにし、それらの成果をまとめた論文を投稿した。本研究で解析を行った特異的な共生変異体nfr1Ca+の解析では、ゲノム編集により作成したnfr1Ca+変異体アリルでもカルシウム振動の発生が確認でき、エコタイプの違いによるNFR1機能の差異が見られることが確認できた。人工的なカルシウム振動の発生については、Caイメージングを行うツールとして、新たにR-GECOを使用したカルシウム振動の観測技術の確立に成功した。このツールを加えて人工的カルシウム振動の発生実験を行っていく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
今年度はAM菌感染させたlys6変異体の根のトランスクリプトーム解析の結果から、lys6変異体で発現誘導が見られなくなるAM共生誘導遺伝子としてEXO70やVAPYRINの同定に成功した。共生遺伝子であるVAPYRINは菌糸の宿主内への侵入過程に関与する機能を持ち、lys6変異体が示す菌糸侵入不全の表現型がこの遺伝子の誘導不全により生じている可能性が示唆された。これらの成果をまとめた論文を現在、投稿中であり（New Phytologist誌 Majour revisionから再投稿中）、当初の予定より早く論文での報告を行うことができた。
人工的なカルシウム振動の発生を行う研究では、Caイメージングを行うツールとして、新たにR-GECOを使用したカルシウム振動の観測技術の確立に成功した。このR-GECOをCaged Ca proteinであるPACR-GFPと共発現させることで、光によるCa2+の放出とその検出を行うことが可能となることから、今後は２つのツールを用いて人工的カルシウム振動の発生実験に取り組むことが可能となった。また、実際に毛状根形質転換法により一過的にR-GECOとPACR-GFPを発現させた個体において、光を照射するとCa2+の放出を確認することができ、数回のオシレーションを発生させることができた。そのためR-GECOとPACR-GFPを発現する組換え個体の作成を行っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
lys6変異において発現が見られなかった遺伝子が菌糸侵入を制御している可能性について検証を行う。具体的にはlys6変異体にVAPYRINを過剰発現させることによりlys6変異表現型を抑制できるかについて解析する。この解析によるAM菌の共生シグナルの受容伝達から菌糸の侵入に至る経路を明らかとすることが可能である。また、LYS6はカルシウム振動の誘導に必須の遺伝子であることから、LYS6制御下にある遺伝子群がカルシウム振動制御下にもある遺伝子である可能性がある。そのため、これらの遺伝子を人工的カルシウム振動の発生時の応答反応の指標として用いることで、カルシウム振動がもつ遺伝子発現制御機構を明らかにしていく。
nfr1Ca+変異体の解析については、nfr1Ca+におけるカルシウム振動発生の表現型がエコタイプの相違によって生じる可能性が変異体アリルの解析により確定したことから、ミヤコグサ野生系統のゲノム配列を取得し、LysM型受容体間での多型の有無の解析を開始している（東北大学 佐藤博士、番場博士提供）。現在のところ少なくともLYS６がnfr1Ca+におけるカルシウム振動発生の一部に関与していることは明らかとなっているが、NFR1がCaスパイキング誘導能を失った原因については特定できていない。今後は探索の範囲を広げて解析を続け、この原因となる遺伝子や変異の同定を目指していく。
マイクロインジェクションによる直接的なCa2+の注入によるカルシウム振動の発生は少数の細胞であるが部分的にはCa2+の周期的な発生には成功している。しかし、その発生が当初の予定とは異なる方法により生じていることから、技術的な検証も含めた再現性をとりつつ、共生シグナル応答としてのカルシウム振動であるかの検証を下流応答反応との関係を観ることで行っていく。
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