| Project/Area Number |
22K06298
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 44040:Morphology and anatomical structure-related
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| Research Institution | Kyushu Sangyo University (2023)
Kyushu University (2022) |
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Principal Investigator |
金子 たかね 九州産業大学, 生命科学部, 准教授 (20363327)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岩森 巨樹 九州大学, 農学研究院, 准教授 (70647362)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
Fiscal Year 2024: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
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| Keywords | MS4A / 精子 / 受精 / 膜タンパク質 |
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| Outline of Research at the Start |
哺乳類の受精機構は、これまで盛んに研究が行われてきたにもかかわらず未だ多くの謎に包まれている。そこで、本研究では、受精に重要な役割を果たす可能性がある膜タンパク質MS4A (membrane-spanning 4-domains, subfamily A) ファミリーの受精における役割を明らかにすることを目的として、ゲノム編集技術を利用してMS4A5、MS4A13およびMS4A14の遺伝子改変マウスを作製し、受精過程を経時的に解析することでMS4Aの機能を解明する。得られた結果と既知の情報を統合することで、哺乳類の受精機構を明らかにすることを目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
令和5年度は、本研究の目的である「受精に重要な役割を果たす可能性がある膜タンパク質MS4A (membrane-spanning 4-domains, subfamily A) ファミリーの受精における役割を明らかにする」ことを目指して、以下の①から③の研究を行なった。
① 免疫組織化学的手法を用いたMS4A5およびMS4A14の詳細な局在解析：令和4年度、MS4A5およびMS4A14タンパク質の精巣および精子における局在解析を、両タンパク質の抗体を用いた免疫組織化学的手法により行ったが、精子形成過程における詳細な局在は不明な点があった。令和5年度は、精巣の生殖細胞の分離法や染色法を改善し、またより精度の高い顕微鏡を使用することで、MS4A5およびMS4A14タンパク質の精子形成過程における詳細な局在解析を行った。
②イムノブロット法を用いたMS4A5およびMS4A14の詳細な局在解析：令和4年度、両タンパク質の抗体を用いて、精巣および精子におけるイムノブロット解析を行った。令和5年度は、詳細な局在を解析するため、数種類の液で溶解した精巣および精子サンプルを用いて解析を行い、MS4A5およびMS4A14タンパク質の詳細な局在解析を行った。
③ゲノム編集技術による遺伝子改変マウスの作製：受精過程におけるMS4A5、MS4A13およびMS4A14の機能を調べるため、令和4年度に作製した遺伝子改変マウスは、解析の結果、問題がみつかった。そのため、令和5年度も、ゲノム編集技術CRISPR/Cas9法を利用して、ノックアウトマウスの作製を試みた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
令和5年度は、研究実施計画通りの研究を行うことができなかった。
その理由としては、令和4年度に作製した遺伝子改変マウスは、解析の結果、問題がみつかったため、令和5年度に、再度、ノックアウトマウスの作製を行う必要が生じたためである。令和5年度に、ゲノム編集技術CRISPR/Cas9法を利用して、MS4A5、MS4A13およびMS4A14のノックアウトマウス作製を試みたが、まだいずれのノックアウトマウスも作製することができておらず、その後の解析ができない状況である。
そのため、令和5年度は、令和4年度の解析で不十分であったMS4A5およびMS4A14の詳細な局在解析を行った。まず、免疫組織化学的手法を用いた局在解析では、精巣の生殖細胞の分離法や染色法を改善し、またより精度の高い顕微鏡を使用することで、両タンパク質の精子形成過程における詳細な局在解析を行うことができた。イムノブロット法を用いた局在解析では、数種類の液で溶解した精巣および精子サンプルを用いて解析を行うことで、両タンパク質の詳細な局在解析を行うことができた。これにより両タンパク質の受精における機能を検討することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和6年度は、以下の①から③の研究を行う。
①今年度こそ、ゲノム編集技術CRISPR/Cas9法を利用して、MS4A5、MS4A13およびMS4A14のノックアウトマウスを作製する。
②ノックアウトマウス作製後は、遺伝子改変マウスにおける精巣および精巣上体の精子を回収し、PCR法、また各MS4A抗体を用いたイムノブロット法および免疫組織化学的手法により、各MS4Aタンパク質が消失していることを確認する。
③次に、各MS4Aタンパク質が消失していることが確認できた遺伝子改変マウスの詳細な解析を行う。まず、遺伝子改変マウスおよび対照マウスの精巣、精巣上体および精子について、大きさおよび重量などを比較、観察する。その後、遺伝子改変マウスおよび対照マウスの精巣、精巣上体および精子について、顕微鏡を用いて精子形成過程から成熟精子までの構造上の異常性を詳細に観察する。また、遺伝子改変マウスおよび対照マウスから精子を回収し、精子の運動性を解析し、精子における形態異常との関連性を調べる。さらに、in vivoおよびin vitroで遺伝子改変マウス精子および対照マウス精子の受精解析を行い比較する。特にin vitroでは、先体反応、透明帯との接着および卵形質膜との接着・融合について、卵丘-卵複合体に進入する精子の経時的変化を詳細に観察することで、各MS4Aの機能をより詳細に調べる。in vivoでは、交尾行動、精子の雌性生殖道での動態および産仔数を含めて観察する。
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