Research on the mechanism of reproductive communication between males and females via peptide sex pheromones
| Project/Area Number |
22K06305
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
|
| Allocation Type | Multi-year Fund |
|---|
| Section | 一般 |
|---|
| Review Section |
Basic Section 44040:Morphology and anatomical structure-related
|
|---|
| Research Institution | Nippon Veterinary and Life Science University |
|---|
Principal Investigator |
中田 友明 日本獣医生命科学大学, 獣医学部, 准教授 (50549566)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2026-03-31
|
| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
|
| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2023: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
|
|---|
| Keywords | 性フェロモン / 両生類 / 生殖行動 / ソデフリン / プロモーター / 遺伝子組換え / アイモリン / ノックアウト / 配偶者選択 |
|---|
| Outline of Research at the Start |
本研究では以下の3点について研究を展開する予定である。
[1]多成分性雄性フェロモンの機能解析：雄イモリの肛門腺に発現するソデフリンとその類縁遺伝子を特異的に欠損させた動物を作成、正常雌との配偶行動や繁殖成功率を正常雄と比較し、個々の性フェロモンの役割を解析する。
[2]各性フェロモン受容体および性フェロモン応答神経系の同定：イモリ性フェロモンの受容体タンパク質は同定されていないため、その遺伝子クローニングや脳内神経系の同定を行う。
[3]各性フェロモンに対する応答神経系の調節機序の解明：生殖期には雌雄とも異性の性フェロモンに応答する感覚細胞が増加するので、その内分泌学的機序を探る
|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、異性の性行動を単一分子で誘起し得る雄性フェロモン（ソデフリン）と雌性フェロモン（アイモリン）が共に同定された四肢動物であるアカハライモリをモデルに、雌雄両性の性フェロモン応答処理中枢神経系と、その内分泌学的調節機序の詳細を解析することを目的としている。初年度にあたる本年は以下の5つの実験を行い、それぞれに一定の成果を得た。
1. 雄性フェロモンソデフリンのノックアウト(KO)動物の作成：ソデフリンペプチドのコード領域上流にあるPAM配列を認識して当該ゲノムDNA配列に得意的な切断をするガイドRNAとCas9酵素をイモリ受精卵に顕微注入することで、ソデフリン遺伝子にNHEJ（非相同末端結合）の修復ミスに起因するフレームシフトを誘発させ、性フェロモンKO動物(F0)を作成した。今後、交配によって非モザイク性のF1動物を得て、解析を行う予定である。
2. 今後の解析に必要なアルビノ個体の準備：ゲノム編集により作成したメラニンを持たないアルビノイモリのF0個体を得て、今後の蛍光シグナルでの解析を容易なものとした。
3. イモリのcrystallinプロモーターのクローニング：水晶体で同プロモーター下流の蛍光タンパク質を発現させ、外来遺伝子導入マーカーとして発生初期に遺伝子導入を確認可能となる。
4.複数のソデフリンパラログ・神経活動依存的に発現する最初期遺伝子（Egr-1およびArc）プロモーターのクローニング：それぞれ、性フェロモンの発現調節機構の解析や、フェロモン受容応答神経系の同定や解析に利用できる。
5. 脳内の神経回路解析に有用な神経細胞標識を達成するBrainBowコンストラクトの作成：複数の蛍光タンパク質の発現を神経細胞ごとにランダムに起こすことで、個々の神経繊維の追跡が可能となるため、今後、同コンストラクトを導入したイモリが応答神経系の同定や解析に利用できる。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題では遺伝子改変動物の利用を計画に含めているが、研究対象のアカハライモリでは既存の改変動物の外部機関からの導入が見込めず、他のモデル動物に非して遺伝子改変に使用できるプロモーターや遺伝子等の入手も自身で行う必要があり、加えて世代時間（受精卵-成熟までの期間）が1年半と比較的長いため、本年度は解析に用いる動物の作成から着手することとした。
結果として、計画した遺伝子改変に必要な遺伝子・プロモーター配列の取得等を現実的に可能な限り行えたことに加え、雄イモリに求愛行動を誘起させる因子に関しても行動学的解析を行い、異性個体から発される視覚刺激・嗅覚刺激の両者が協調して雄イモリの求愛行動の発現率を変化させることを見出すとともに、雌イモリからは未知の求愛行動誘発因子が分泌されていることが強く示唆されたため、次年度以降も継続して求愛行動誘発因子の実態に迫る予定である。
以上のことから、研究はおおむね順調に進展していると考える。
|
| Strategy for Future Research Activity |
本年度に取得・作成した各種のイモリプロモーター配列やKO動物を用いて、性フェロモンの受容に関わる神経回路同定に利用可能な遺伝子改変動物を作成・解析を行う。すなわち、①神経活動依存的に発現する最初期遺伝子（Egr-1およびArc）プロモーター下流にレポータータンパク質を配した動物を作成し、性フェロモンの受容時や求愛時に発火する神経を可視化できる動物を作成する（同レポーター蛍光シグナルが対象となる行動発現時のみの神経活動を記録するよう、薬剤によるリコンビナーゼ誘導後にレポータータンパク質の発現が誘起されるTet-onシステムを使用する）。②ソデフリンKOイモリのF1動物を得て、その表現型を解析する。ただし、ソデフリンの欠損によって著しい生殖活動（雌雄間コミュニケーション等）への障害が予想され、F1動物が自然交配によって得られない場合、適宜人工受精などを行いF1動物を得て解析を行う。
また、樹脂製の雌イモリ模型の総排出孔から雌イモリ飼育水をシリンジポンプによって排出させると、性成熟した雄が模型に対して求愛行動を発現することがわかったため、雌飼育水中に含まれる雄の求愛行動誘発因子の同定（飼育水中からの活性物質の精製）を行うとともに、その物質と模型の示す視覚的刺激がいかに連携して雄の求愛行動を発現させているのかを調べる予定である。
|
Report
(1 results)
Research Products
(1 results)
