Development of a system for the mass analysis of nuclear chromatin structure at the one-cell level with positional information in plant tissues

• Project/Area Number: 22K06333
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 45010:Genetics-related
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 長岐 清孝 岡山大学, 資源植物科学研究所, 准教授 (70305481)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2024: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000); Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2022: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
• Keywords: クロマチン / 画像機械学習 / 核内構造 / 組織標本 / 人工知能

Outline of Research at the Start

「核内クロマチン構造は、植物種間および細胞種間において、どの様な特異性および多様性をもつのか？」を本研究の学術的な問いとし、本研究ではこれらを解明するために申請者らが開発した「植物組織標本を用いたクロマチン解析法」を高感度化し、「AIによる染色体画像の高速解析法」と組み合わせ高速化することにより、植物組織内の異なる細胞種の核内クロマチン構造の大量高速解析系を構築する。得られた情報をもとに、核内クロマチン構造の特異性および多様性を解明する。

Outline of Annual Research Achievements

「核内クロマチン構造は、植物種間および細胞種間において、どの様な特異性および多様性をもつのか？」を本研究の学術的な問いとし、本研究では、これらを解明するために申請者らが開発した「植物組織標本を用いたクロマチン解析法」高感度化し、「AIによる細胞画像の高速解析法」と組み合わせることにより、植物組織内の異なる細胞種の核内クロマチン構造の大量高速解析系を構築し、核内クロマチン構造の特異性および多様性を解明する。
本年度は、ゲノム編集に用いられるSpCas9酵素にStrep-tagIIを付加した融合タンパク質を作製した。このStrep-tagII付加SpCas9酵素と標的DNA配列認識のための標的特異的crRNAおよび1分子の蛍光色素を付加した汎用tracrRNAにより形成させた複合体に、蛍光色素を結合したストレプトアビジンを特異的に結合させることにより、Cas9複合体あたりの蛍光色素数を増加し、この複合体を用いた検出法の検出感度の向上を試みた。しかしながら、理論的には、この方法により、数倍の蛍光が得られるはずだが、わずかな蛍光の増加のみしか検出されなかった。
並行して、SpCas9 酵素(160 kDa)よりも分子量の小さいSaCas9酵素 (130 kDa)を用いた、組織浸透性の向上および浸透性向上によるシグナル強度の増加も試みたが、SaCas9酵素を用いた系では、検出可能なシグナルが得られなかった。現在、これについての原因を究明している。
加えて行ったAIを用いた画像解析においては、学習画像の数を増やすことにより、これまで90-95%であった細胞周期の各時期の細胞の検出感度を95-98%へ向上することができた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

計画通りのアプローチで研究を進めているが、SpCas9酵素を用いた系ではシグナル強度の向上が得られていない点、SaCas9酵素を用いた系ではシグナルが得られていない点において遅れていると判断した。しかし、AIによる細胞画像検出においては検出感度を向上することができたため、全体として「やや遅れている」と判断した。

Strategy for Future Research Activity

SpCas9酵素を用いた検出系では、SpCas9酵素に付加するStrep-tagIIの数を増加させることにより、シグナル強度の向上を試みる。SaCas9酵素を用いた検出系については、crRNA配列を変更するなどして、問題点を明らかにし、組織浸透性および検出感度の向上を目指す。AIによる細胞画像検出については、引き続き学習画像および学習回数を増やすことにより、検出感度の向上を目指す。

Research Products

• [Book] Plant Cytogenetics and Cytogenomics (2023)
  • Author(s): Bhanu Prakash Potlapalli, Takayoshi Ishii, Kiyotaka Nagaki, Saravanakumar Somasundaram, Andreas Houben
  • Total Pages: 568
  • Publisher: Humana New York, NY
  • ISBN: 9781071632253
• [Remarks] みんなの画像機械学習
  • URL: https://www.rib.okayama-u.ac.jp/nucleus/ML/