| Project/Area Number |
22K06335
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
|
| Allocation Type | Multi-year Fund |
|---|
| Section | 一般 |
|---|
| Review Section |
Basic Section 45010:Genetics-related
|
|---|
| Research Institution | Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science |
|---|
Principal Investigator |
柴田 武彦 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, 研究員 (70087550)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
廣田 耕志 東京都立大学, 理学研究科, 教授 (00342840)
正井 久雄 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, 所長 (40229349)
笹沼 博之 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, 副参事研究員 (00531691)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
|
| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
|
| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
|
|---|
| Keywords | 相同DNA組換え / 相同DNA対合 / RecA/Rad51族組換え酵素 / ハイブリッド二本鎖 / 相同三重鎖 / 組換え中間体 / ヘテロ二重鎖DNA / ハイブリッド二重鎖DNA / 相同対合反応 / RecA / Rad51 / 相同組換え修復 / 相同並行三重鎖 / ハイブリッド二重鎖 / Ｄループ |
|---|
| Outline of Research at the Start |
相同的組換えがDNA二本鎖切断を正確に修復してゲノムを維持する。相同的組換えの要は、切断端からできる単鎖(ss)DNA域が二重鎖(ds)DNAの中から互いに相同な配列を見つけハイブリッドds (Hyb-ds) を作る反応である。この反応の仕組みは未だに定説がない。ある酵素がdsDNAの塩基対を開き、できたss域で相手のssDNAとアニールしてHyb-dsをつくる「二重鎖開裂が先」モデルと、逆に、ds構造が開く前にssDNAとの相同配列が見つけ出される「二重鎖開裂が後」モデルとがある。本研究では「二重鎖開裂が後」モデルにだけ想定される「相同並行三重鎖」の存在を示すことで、このモデルの確証を得る。
|
| Outline of Annual Research Achievements |
RecAがdsDNAの塩基対を開き、できたss域で相手のssDNAとアニールしてハイブリッド二本鎖 (Hyb-ds) をつくる「二重鎖開裂が先」モデルと、逆に、ds構造が開く前にssDNAとの相同配列が見つけ出される「二重鎖開裂が後」モデルとがある。RecAによるHyb-ds 形成で最初にできる6-8塩基程度の核が、「二重鎖開裂が後」モデルに特有な相同並行三重鎖であることを示すことで「二重鎖開裂が後」モデルが正しいことを示す証拠を得ることが、本研究の目的である。そのためには、高感度二本鎖DNA巻き戻しアッセイと共に、Hyb-ds核形成の機能を保ちながら、その核をＤループへ変換し、成長させるRecAの第2の機能を抑制できるかが鍵になる。
a. Hyb-dsの核をＤループへ変換し、成長させるRecAの第２の機能を抑制し、Hyb-ds核形成段階でトラップするためのrecA変異体候補として、Yangらのクライオ電子顕微鏡解析(Nature 2020) の結果から明らかになった、Ｄループの両端で二本鎖DNAの解列を安定化しているL2ループ先端のPhe203をAlaに置換したF203A変異をもつrecA変異体を精製して、Ｄループ形成への影響を解析した。その結果、F203A変異recAでもＤループを形成することが分かり、Phe230による二本鎖DNA解列はＤループ形成に必須ではないことがわかった。
b. 高感度ds巻き戻しアッセイ系を開発して、RecA野生型によるＤループ形成過程での二本鎖DNAの巻き戻しを解析した。その結果、一本鎖DNAとの相同配列を探している段階では、3000塩基対の二本鎖DNAは1回転の巻き戻しも起こらず、互いに相同な塩基配列を識別した後に初めて二本鎖DNAの巻き戻しが起こることを明らかにした。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究実績の概要のa とb で述べた結果は、「二重鎖開裂が先」モデルとは相いれず、「二重鎖開裂が後」モデルを支持する。この結果は、「二重鎖開裂が後」モデルが正しいことを示す証拠と言える。これらの結果をまとめた論文は、2023年年末に、Nucleic Acids Research 誌 (IP: 19) に受理され、2024年の初頭に出版された。
|
| Strategy for Future Research Activity |
野生型RecAはＤループを精製したのち、ATP加水分解に依存してできたＤループを一本鎖DNAの5'-3'へ移動させて解離する「Ｄループ加工」活性を合わせて持つ。Hyb-dsの核をＤループへ変換し、成長させるRecAの第２の機能を抑制し、Hyb-ds核形成段階でトラップするためのrecA変異体候補として取得、精製した、Ｄループの両端で二本鎖DNAの解列を安定化しているL2ループ先端のPhe203をAlaに置換したF203A変異をもつrecA変異は、Ｄループは形成するが、できたＤループを解離することができないことが分かった。その結果、F203は、むしろ、相同三重鎖をＤループに成熟させる機能をもつ可能性が、また、203A変異はHyb-ds核形成段階でトラップする可能性が示唆された。さらに、相同三重鎖とＤループとを区別する手法を導入し、この課題の目的である相同三重鎖の存在の検証を行う。
|
