深海性二枚貝の鰓細胞が共生細菌を取り込む際の３次元的形態プロセスの実証

• Project/Area Number: 22K06351
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 45020:Evolutionary biology-related
• Research Institution: Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology
• Principal Investigator: 生田 哲朗 国立研究開発法人海洋研究開発機構, 地球環境部門(海洋生物環境影響研究センター), 研究員 (80584846)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2024: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000); Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
• Keywords: 化学合成 / 共生細菌 / シンカイヒバリガイ / 水平感染 / トモグラフィー / 化学合成細菌 / 共生進化 / 水平伝播 / 細胞形態

Outline of Research at the Start

化学合成独立栄養細菌との共生は、動物の深海環境への適応進化を可能にした生命現象であり、共生細菌の獲得はその核となる機構である。本研究では、共生細菌を環境から鰓細胞に取り込むシンカイヒバリガイ類を用いて、先進的な分子・組織学的解析手法を駆使しながら、共生細菌取り込みの初期過程を詳細に観察することによって、シンカイヒバリガイ類と化学合成細菌の共生が成立する際の細胞レベルの形態的プロセスを３次元的に明らかにする。

Outline of Annual Research Achievements

2022年度は、シンカイヒバリガイ類と化学合成細菌の共生が成立する際の細胞レベルの形態的プロセスを３次元的に明らかにすることを目的とし、以下の研究を行なった。
・試料採取のための深海調査航海の実施：伊豆小笠原海域明神海丘（深度約1,300 m）と相模湾初島沖（深度約900 m）に無人深海探査機で潜航し、それぞれの海域でシチヨウシンカイヒバリガイ（Bathymodiolus septemdierum）およびシンカイヒバリガイ（B. japonicus）を予定通り採集し、各種分析項目に応じた固定を行なった。また明神海丘においては、生息現場に設置していた再感染実験の個体も回収し、固定した。
・蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）法による共生細菌遺伝的バリエーションの解析：シチヨウシンカイヒバリガイ稚貝鰓上皮細胞１細胞ごとに含まれる個々の共生細菌の遺伝的多様性を可視化するため、共生細菌１つ１つのシグナルを識別する高解像観察が可能なFISH法を検討した。現在、技術的検討を続けており、プローブの調製も進めている。
・トモグラフィー法による菌保有細胞の３次元観察：シチヨウシンカイヒバリガイにおける初期の共生菌取り込みプロセスを３次元的に明らかにするため、稚貝鰓の超薄連続切片を作成し、共生細菌を宿す鰓上皮菌保有細胞の超微細構造を走査型電子顕微鏡で撮影した。撮影画像から目的の構造をトレースして分割し、３次元再構成を行なった。その結果、分析個体数はまだ少ないものの、取り込み初期の細胞形態プロセスについて当初の仮説とは異なる様子が見出された。今後観察例数を増やし、新たな取り込みモデルを構築することが必要と考えられた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

・トモグラフィー法による菌保有細胞の３次元観察は2022年度実施の計画通り開始したが、稚貝鰓の切片試料の調整と電子顕微鏡による観察に時間を要した上に、解析対象となる細胞が予想外に少なく、計画より少数の観察例にとどまっている。しかし、今年度観察した中では取り込み初期の細胞形態プロセスについて当初の仮説とは異なる様子が窺われ、新たなモデル構築への展望が開けた。
・蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）法による共生細菌遺伝的バリエーションの解析は2023年度実施予定のところ、先行して技術的な検討とプローブの調製を開始した。

Strategy for Future Research Activity

蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）法による共生細菌遺伝的バリエーションの解析：今年度先行して開始した技術的な検討とプローブの調製を進め、シチヨウシンカイヒバリガイ稚貝サンプルを用いてFISH法による共生細菌亜集団の分布解析を行う。画像取得には高解像観察が可能なレーザー共焦点顕微鏡を用い、1宿主細胞内における共生細菌の分布パターンを３次元的に明らかにする。また、FISH法による染色を施した細胞をマイクロダイセクションにより切り出して回収し、次世代シークエンスにより細胞内での共生細菌の遺伝的多様性を解析する。
・トモグラフィー法による菌保有細胞の３次元観察：今年度に引き続き、シチヨウシンカイヒバリガイ稚貝鰓の超薄連続切片を作成し、共生細菌を宿す鰓上皮菌保有細胞の超微細構造の３次元的解析を進める。観察対象の細胞については保有菌数のより少ないもの、より多いものと、共生細菌取り込み過程をできる限り広くカバーするものを選択し、研究開始当初に提示されていた仮説とは異なる、取り込みプロセスについての新たなモデル構築を目指す。また、シンカイヒバリガイにおいても同様の解析を行い、両種を比較することによって、シンカイヒバリガイ類における細胞内共生の進化過程を検討する。