深海性二枚貝の鰓細胞が共生細菌を取り込む際の３次元的形態プロセスの実証

Research Project

Project/Area Number	22K06351
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 45020:Evolutionary biology-related
Research Institution	Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology
Principal Investigator	生田哲朗国立研究開発法人海洋研究開発機構, 地球環境部門(海洋生物環境影響研究センター), 副主任研究員 (80584846)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000) Fiscal Year 2024: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000) Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Keywords	化学合成 / 共生細菌 / シンカイヒバリガイ / 水平感染 / トモグラフィー / 化学合成細菌 / 共生進化 / 水平伝播 / 細胞形態
Outline of Research at the Start	化学合成独立栄養細菌との共生は、動物の深海環境への適応進化を可能にした生命現象であり、共生細菌の獲得はその核となる機構である。本研究では、共生細菌を環境から鰓細胞に取り込むシンカイヒバリガイ類を用いて、先進的な分子・組織学的解析手法を駆使しながら、共生細菌取り込みの初期過程を詳細に観察することによって、シンカイヒバリガイ類と化学合成細菌の共生が成立する際の細胞レベルの形態的プロセスを３次元的に明らかにする。
Outline of Annual Research Achievements	2023年度は、シンカイヒバリガイ類と化学合成細菌の共生が成立する際の細胞レベルの形態的プロセスを３次元的に明らかにすることを目的とし、以下を実施した。・解析に用いる試料を追加するための深海調査航海の実施：伊豆小笠原海域明神海丘（深度約1,300 m）と相模湾初島沖（深度約900 m）に潜航し、各海域でシチヨウシンカイヒバリガイ（Bathymodiolus septemdierum）およびシンカイヒバリガイ（B. japonicus）を採集し、各種分析項目に応じた固定を行なった。・蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）法による共生細菌遺伝的多様性の解析：シチヨウシンカイヒバリガイ稚貝鰓上皮細胞１細胞ごとに含まれる、個々の共生細菌の遺伝的多様性を高解像度で可視化するFISH法を検討した。現在までに明瞭なシグナルを得るには至っていない。・レーザーマイクロダイゼクション法による共生細菌遺伝的多様性の解析：FISH法による解析を補完するため、鰓の組織切片試料から１細胞をマイクロダイセクション顕微鏡により切り出して回収し、DNAシークエンスにより個々の鰓細胞の共生細菌の多様性を解析する手法の検討を行った。・トモグラフィー法による菌保有細胞の３次元観察：シチヨウシンカイヒバリガイにおける初期の共生菌取り込みプロセスを３次元的に明らかにするため、前年度に引き続き、稚貝鰓の超薄連続切片を作成して、共生細菌を宿す鰓上皮菌保有細胞の超微細構造を走査型電子顕微鏡で撮影した。撮影画像から目的の構造をトレースして抽出し、３次元再構成を行なった。その結果、取り込み初期の細胞形態プロセスについて当初の仮説とは異なる様子が見出された。また、対照種であるシンカイヒバリガイでも同様の解析を開始し、本種で予想されていた取り込み初期のプロセスとは異なる様子が見出されつつある。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason ・前年度に引き続き、トモグラフィー法によるシチヨウシンカイヒバリガイ稚貝鰓細胞の３次元観察を行った。稚貝鰓の切片試料の調整と電子顕微鏡による観察に時間を要したが、観察例数を増やすことで、取り込み初期の細胞形態プロセスについて当初の仮説とは異なることに確証が得られた。この結果について学会発表を行った。また、対照種であるシンカイヒバリガイでも同様の解析を行い、まだ観察例数は少ないが、本種で予想されていた取り込み初期のプロセスとは異なる様子が見出されつつある。・蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）法による共生細菌の遺伝的多様性の解析を開始した。１宿主細胞内の菌株が同一であるかの確認には至っていない。１細胞全体が入る切片の厚みで、共生細菌の遺伝的多様性を高解像度で可視化する手法の検討を進めているが、これまでに明瞭なシグナルは得られていない。・レーザーマイクロダイゼクション法による共生細菌遺伝的多様性の解析を開始した。鰓の切片から１細胞をマイクロダイセクション顕微鏡によりレーザー照射で切り取り回収する手法の検討を行った。切片からの切り出しが可能なことは分かったが、稚貝鰓の目的の細胞を確実に回収するためにはさらに手法の改善が必要なことが分かった。
Strategy for Future Research Activity	・蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）法による共生細菌遺伝的バリエーションの解析：さらに手法を改善し、シチヨウシンカイヒバリガイ稚貝サンプルを用いてFISH法による共生細菌亜集団の分布解析を行う。画像取得には高解像観察が可能なレーザー共焦点顕微鏡を用い、1宿主細胞内における共生細菌の分布パターンを３次元的に明らかにする。・レーザーマイクロダイゼクション法による共生細菌遺伝的多様性の解析：シチヨウシンカイヒバリガイ稚貝の鰓細胞をマイクロダイセクションにより切り出して回収する手法を確立し、次世代シークエンスにより細胞内での共生細菌の遺伝的多様性を解析する。・トモグラフィー法による菌保有細胞の３次元観察：引き続き、シチヨウシンカイヒバリガイおよびシンカイヒバリガイ稚貝鰓の超薄連続切片を作成し、共生細菌を宿す鰓上皮菌保有細胞の超微細構造の３次元的解析を進める。観察対象の細胞については保有菌数のより少ないもの、より多いものと、共生細菌取り込み過程をできる限り広くカバーするものを選択し、研究開始当初に提示されていた仮説とは異なる、取り込みプロセスについての新たなモデル構築を目指す。また、２種の結果を比較することによって、シンカイヒバリガイ類における細胞内共生の進化過程を検討する。・免疫組織染色による膜小室の食胞の性質の確認：現在までに本研究でシチヨウシンカイヒバリガイおよびシンカイヒバリガイで観察された、共生細菌取り込みの際に形成される鰓細胞表面の構造が貪食作用と関係があるのかを調べるため、食胞マーカーとして知られる幾つかのタンパク質についてペプチド抗体を作成し、この構造が食胞に由来するものなのかを検証する。・以上の成果をまとめて関連学会および国際誌上で発表する。